Summary

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

Published: September 06, 2018
doi:

Summary

De productie van gespecialiseerde netvlies cellen uit pluripotente stamcellen is een keerpunt in de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie voor retinale ziekten. De huidige paper beschrijft een eenvoudige methode voor een efficiënte generatie van retinale organoids en retinale pigment epitheel voor fundamenteel, translationeel, en klinisch onderzoek.

Abstract

De productie van gespecialiseerde cellen uit pluripotente stamcellen biedt een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor regeneratieve geneeskunde. Het gebruik van mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) is met name aantrekkelijk voor neurodegeneratieve ziekte studies, met inbegrip van retinale dystrophie, waar retinale cel iPSC-afgeleide modellen markeert een belangrijke stap voorwaarts te begrijpen en bestrijden van blindheid. In deze paper beschrijven we een eenvoudige en schaalbare protocol to generate, oudere, and cryopreserve retinale organoids. Op basis van middellange veranderende, het belangrijkste voordeel van deze methode is om te voorkomen dat meerdere en tijdrovende stappen vereist vaak een begeleide differentiatie van iPSCs. Het nabootsen van de vroege fasen van retinale ontwikkeling door opeenvolgende wijzigingen van gedefinieerde media op aanhangend menselijke iPSC culturen, dit protocol kunt gelijktijdige opwekking van zelf vorming neuroretinal structuren en netvlies gepigmenteerde epitheliale (RPE) cellen in een reproduceerbaar en efficiënte wijze in 4 weken. Deze structuren met retinal voorlopercellen (RPC’s) kunnen gemakkelijk geïsoleerd voor verdere rijping in een zwevende cultuur voorwaarde waardoor de differentiatie van RPC’s in de zeven retinale celtypes in het volwassen menselijke netvlies aanwezig. Daarnaast beschrijven we snelle methoden voor cryopreservatie van retinale organoids en RPE cellen voor langdurige opslag. Samen, zijn de hier beschreven methoden nuttig om te produceren en bank menselijke iPSC afkomstige netvlies cellen of weefsels voor zowel fundamenteel en klinisch onderzoek.

Introduction

Het netvlies is een integraal onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CNS) en heeft een beperkte capaciteit om spontaan regenereren na een traumatisch letsel of ziekten. Daarom, degeneratieve aandoeningen veroorzaken definitieve retinale cel verlies, zoals leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaucoom en diabetische retinopathie, meestal leiden tot onomkeerbare blindheid. Redden van de ontaarde netvlies is een grote uitdaging waarvoor de stamcel gebaseerde therapieën gericht op het vervangen van de beschadigde of verloren cellen een van de meest beloftevolle benaderingen1,2,3 zijn. Pluripotente stamcellen als menselijke embryonale stamcellen (SER’s) cellen of mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) hebben de capaciteit worden uitgebreid voor onbepaalde tijd in cultuur, en ze hebben het potentieel voor de productie van alle celtypes. Vooruitgang in ons begrip van retinale ontwikkeling en de verbetering van de in vitro protocollen voor menselijke iPSC differentiatie hebben geresulteerd in de generatie van retinale organoids7,8,9, 10,11,12. Alle grote netvlies cellen, met inbegrip van retinale peesknoopcellen (RGCs), researchdieren en netvlies gepigmenteerde epitheliale (RPE) cellen, is met succes ligt in gedifferentieerde van menselijke SER’s en iPSCs4,5, 6. op basis van de SFEB (serumvrij cultuur van embryoid lichaam-achtige aggregaten) methode ontwikkeld door Eiraku et al. 13, zelf vorming van retinale organoids kan worden verkregen bij de ESC – of iPSC-afgeleide embryoid lichaam-achtige aggregaten in gedefinieerde extracellulaire matrix onderdelen7,10,14. Maar deze protocollen zijn ingewikkeld, vereisen van een groot aantal stappen niet altijd compatibel met de grote productie van cellen voor therapeutische benaderingen of drug screening. Dus, de keuze van de methode voor de productie van menselijke netvlies cellen is kritisch en de methode moet robuust, schaalbaar en efficiënt.

Hier beschrijven we elke stap is gebaseerd op onze eerdere publicatie15, voor een eenvoudige en efficiënte generatie netvlies cellen door retinale organoid zelf vorming van aanhangend menselijke iPSCs gekweekt in een feeder-gratis en xeno-gratis staat. Vanaf routine culturen van aanhangend menselijke iPSCs, vereist dit protocol slechts een eenvoudige opeenvolgende medium wijzigen zodat de generatie van zowel iPS-afgeleide RPE (hiRPE)-cellen en neuroretinal structuren in 4 weken. Na een handmatige isolatie, hiRPE kan worden uitgebreid en de retinale structuren kunnen worden gekweekt als zwevende organoids waar de retinale voorlopercellen zijn bekwaam om te onderscheiden in alle retinale celtypes in een volgorde die consistent is met de mens in vivo retinogenesis. Tot slot, voor onderzoek vooruitgang of klinische vertaling beschrijven we een cryopreservatie methode waardoor de langetermijnopslag van hele netvlies organoids en hiRPE cellen zonder hun fenotypische kenmerken en functionaliteit.

Protocol

Het protocol beschreven in dit document volgt de richtsnoeren van het Institut de la Vision onderzoek ethisch comité. Het Institut de la Vision heeft de manipulatie van menselijk specimen volgens de huidige Franse verordening gekregen. Specimen behandeling volgt patiënt gegevensbescherming overeenkomstig de beginselen van Helsinki, en de nationale regelgevers na de ethische goedkeuring van het “Comité de bescherming des Personnes (CPP) Ile-de-France V”. 1. bereiding van de voedingsbodems en d…

Representative Results

De eerste stap voor menselijke iPSC differentiatie in feeder-vrij voorwaarden16 verbouwd is zelf-vernieuwing machines met behulp van Bi middellange ter bevordering van een spontane differentiatie (figuur 1A) afsluiten. Vervolgens op D2, het Bi-medium wordt aangevuld met een supplement van de N2 om te differentiëren iPSCs cellen naar het neurale en netvlies lineages begeleiden. Dit proces leidt tot de verschijning van neuroretinal topp…

Discussion

Dit protocol wordt beschreven hoe RPE cellen en netvlies organoids, met retinale RGCs en researchdieren, van menselijke pluripotente stamcellen in xeno-vrij en feeder-vrij voorwaarden te produceren. Compatibel met het proces van Good Manufacturing Practice (GMP), de methode geteeld hier gepresenteerd staat een grote productie van iPSC-afgeleide netvlies cellen als RPE cellen, RGCs en researchdieren voor de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapieën en drug ontdekking benaderingen voor de toekomstige behandeling van …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank de leden van de Goureau team voor hun inbreng tijdens de opbouw van de hier beschreven methoden en G. Gagliardi, M. Garita voor hun kritische lezing. Dit werk werd gesteund door subsidies van de ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), de vereniging Retina Frankrijk en de technologieoverdracht bedrijf SATT Lutech. Het werd ook uitgevoerd in het kader van de LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) ondersteund door de ANR binnen het Investissements d’Avenir programma (ANR-11-IDEX-0004-02).

Materials

Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A14700 Coating
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated ThermoFisher Scientific A27940 Coating
Essential 8 Medium ThermoFisher Scientific A1517001 medium
Essential 6 Medium ThermoFisher Scientific A1516401 medium
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement ThermoFisher Scientific A1370701 supplement CTS
N-2 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502048 supplement
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044 supplement
CTS B-27 Supplement, XenoFree ThermoFisher Scientific A1486701 supplement CTS
DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific 11320074 medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140035 supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122 antibiotic
CellStart CTS ThermoFisher Scientific A1014201 Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix ThermoFisher Scientific A1569601 Matrix
Gentle Cell Dissociation Reagent Stemcell Technologies 7174 dissociation solution
Cryostem Freezing Media clinisciences 05-710-1D Cryopreservation medium
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Preprotech 100-18B FGF2
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free Preprotech AF-100-18B FGF2 Xeno free
AGANI needle 23G Terumo AN*2332R1 Needle
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated Falcon 353109 T-25 cm²
24 well plate Tissue Culture Treated Costar 3526 24-well plate
6 well plate Tissue Culture Treated Costar 3516 6-well plate

References

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Play Video

Cite This Article
Slembrouck-Brec, A., Nanteau, C., Sahel, J., Goureau, O., Reichman, S. Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models. J. Vis. Exp. (139), e57795, doi:10.3791/57795 (2018).

View Video