Hypofysen är en nyckel endokrina organ hos ryggradsdjur ligger nedanför hypotalamus och posteriort den optiska chiasm. Den producerar och utsöndrar sex till åtta hormoner från de specifika celltyper. Hypofysen hormoner utgör en intermediär mellan hjärnan och perifera organ och köra ett brett utbud av grundläggande fysiologiska processer, inklusive tillväxt, reproduktion och reglering av homeostas. Liknande till nervceller, endokrina celler i hypofysen är elektriskt retbara med möjlighet att avfyra handlingspänningar spontant ¹. Dessa nervimpulsernas roll är cellen beroende. I flera celltyper av däggdjur hypofysen, kan handlingspänningar höja den intracellulära Ca^{2 +} tillräckligt för en fördröjd frisättning av hormon ². Dessutom får hypofysen både stimulerande och hämmande information från hjärnan som påverkar membranet potential celler ^3,4,5,6. Typiskt, stimulerande input ökar retbarhet och ofta involverar frisättning av Ca^{2 +} från intracellulära butiker samt ökade bränning frekvens ⁷. Förstå hur cellen använder ion kanal sammansättning och anpassar sig till dessa signaler från hjärnan är nyckeln till förståelse hormon syntes och frisättning.

Patch-clamp tekniken utvecklades i slutet av 1970 av Sakmann Stuttgart och Neher ^8,9,10 och förbättras ytterligare genom Hamill ¹¹, och tillåter detaljerade undersökningar av elektrofysiologiska egenskaper hos celler ner till enda jonkanaler. Tekniken kan dessutom användas för att studera både ström och spänning. Idag är patch-fastspänning den gyllene standarden för att mäta elektrofysiologiska egenskaper av cellen. Fyra stora konfigurationer av tät förslutning patch-clamp teknik har varit utvecklade ¹¹; den cell-anslutna, inifrån och ut, utsidan-out och hela-cell plåstret. De tre första konfigurationerna används vanligtvis för enda Jonen kanaliserar utredningar. För det fjärde, efter den cell-anslutna konfigurationen, görs ett hål i cellmembranet med hjälp av sub atmosfäriska trycket. Denna konfiguration tillåter också utredningar av ion kanal sammansättningen av hela cellen ¹². En begränsning med denna teknik är dock att cytoplasmiska molekyler späds av patch pipett lösning ¹³ (figur 1A), vilket påverkar de elektriska och fysiologiska Svaren studerade celler. Några av dessa molekyler kan faktiskt spelar viktiga roller i transduktion av signalen eller i regleringen av olika jonkanaler. För att undvika detta, utvecklat Lindau och Fernandez ¹⁴ en metod där en por-bilda förening läggs till patch pipetten. Efter den cell-anslutna konfigurationen, föreningen kommer att införliva i plasmamembranet under plåstret och långsamt perforate membranet att skapa elektrisk kontakt med cytosolen (figur 1B). Flera olika antimykotika såsom nystatin ¹⁵ och amfotericin B ¹⁶eller ytaktiva ämnen såsom den saponin beta-escin ^17,18 kan användas. Dessa föreningar skapa porer som är tillräckligt stor för att tillåta monovalenta ering och Cl^– diffusion mellan cytosolen och patch pipetten samtidigt bevara de cytosoliska nivåerna av makromolekyler och större joner som Ca^{2 + 15, 16}.

Utmaningen att använda perforerade patch är potentiellt hög serie motstånd. Serie motstånd (R_s) eller access motstånd är det kombinera motståndet över patch pipetten i förhållande till marken. Under patch-clamp inspelningar, den R_s kommer vara parallellt med membran motstånd (R_m). R_m och R_s i parallell arbete som en spänningsavdelare. Med hög R_s, faller spänningen över den R_s ger fel i inspelningarna. Felet blir större med större strömmar registreras. Spänningsavdelaren är dessutom också frekvens beroende skapar ett lågpassfilter, vilket påverkar den temporal upplösningen. I praktiken tillåta perforerade plåstret inte alltid inspelningar av stora och snabba strömmar som spänningen gated Na⁺ strömmar (för detaljerade avläsningar se referens ¹⁹). R_s kan dessutom variera under patch-clamp inspelningar, igen leder till förändringar i den inspelade aktuellt. Således, falska positiva kan uppstå i situationer där R_s ändras under drog ansökan.

Elektrofysiologi på skivad vävnad introducerades av Andersen lab att studera elektrofysiologiska egenskaper av nervcellerna i hjärnan ²⁰. Tekniken banade väg för detaljerade undersökningar av enstaka celler liksom cell-cell kommunikation och cell kretsar i en mer intakt miljö. En liknande teknik för att göra hypofysen skivor introducerades 1998 av Guérineau et al. ²¹. det var dock inte före 2005, hjärnan-hypofys slice preparatet används framgångsrikt för patch-clamp studier i lever ²². I denna studie rapporterade författarna också användningen av perforerade patch-clamp inspelningar. Dock överlägset har de flesta av de elektrofysiologiska undersökningarna av hypofysen celler utförts hos däggdjur, och endast en handfull andra ryggradsdjur, inklusive lever fisk ^1,2,22,23 . I Benfiskar utfördes nästan alla studier på primära dissocierade celler ^{24,25,26,27,28,29,30} .

I detta dokument beskriver vi en optimerad protokollet för beredning av friska hjärnan-hypofys skivor från den modell fisk medaka. Metoden representerar flera fördelar jämfört med primär dissocierade cellkulturer. Först registreras cellerna i en relativt bevarad miljö jämfört med separerade cell odlingsbetingelser. Andra, slice preparat tillåter oss att studera indirekta vägar medieras av cell-cell kommunikation ²², vilket inte är möjligt i dissocierade cell odlingsbetingelser. Dessutom visar vi hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar på erhållna vävnad skivor med perforerade hela-cell patch-clamp teknik med amfotericin B som por-bilda agent.

Medaka är en liten sötvattensfisk som infödda till Asien, främst hittat i Japan. I fysiologi, embryologi och genetik av medaka har studerats för över 100 år ³¹, och det är en vanligt förekommande forskning modell i många laboratorier. Av särskild betydelse för denna uppsats är den distinkta morfologiska organisationen av hypotalamus-hypofys komplexet i lever fisk: medan hos däggdjur och fåglar hypotalamus nervceller släpper sin neuro-hormoner reglerar hypofysen endokrina celler in i portalen systemet av den medianen eminens finns det en direkt nervös projektion av hypotalamus nervceller på hypofysen i lever fisk ³²endokrina celler. Därför är noggrant genomförda hjärnan-hypofys skivning av särskild betydelse i fisk, vilket tillåter oss att undersöka elektrofysiologiska egenskaper av hypofysen celler i en välbevarad hjärnan-hypofys-nätverk, och i synnerhet hur hypofysen celler styra sin retbarhet och därmed Ca^{2 +} homeostas.