Hypofysen er en nøkkel endokrine organ i virveldyr ligger under hypothalamus og bakenfor optikk chiasm. Det produserer og skiller ut seks til åtte hormoner fra de spesifikke celletyper. Hypofysen hormoner utgjør et mellomledd mellom hjernen og eksterne organer og kjøre en rekke viktige fysiologiske prosesser, inkludert vekst og reproduksjon regulering av homeostase. Lik neurons, endokrine cellene i hypofysen er elektrisk nervøs muligheten til å skyte action potensialer spontant ¹. Rollen som disse action potensialene er celle avhengige. I flere celletyper pattedyr hypofysen, kan action potensialer heve den intracellulær Ca^{2 +} tilstrekkelig for en vedvarende release av hormon ². I tillegg mottar hypofysen både stimulerende og hemmende informasjon fra hjernen som påvirker membran potensialet i celler ^3,4,5,6. Vanligvis stimulerende input øker excitability og ofte innebærer utgivelsen av Ca^{2 +} fra intracellulær butikker samt økt avfyring frekvens ⁷. Forstå hvordan cellen benytter ion kanal sammensetningen og tilpasser seg disse inngangssignaler fra hjernen er nøkkelen til forståelse hormon syntese og slipp.

Patch-klemme teknikken ble utviklet i 1970 av Sakmann og Neher ^8,9,10 og ytterligere forbedret av Hamill ¹¹, og gir detaljerte undersøkelser av elektrofysiologiske egenskaper av celler ned enkelt ionekanaler. Videre er kan teknikken brukes for å studere både strøm og spenning. I dag, er patch-klemanordning gull standard for måling av elektrofysiologiske egenskaper av cellen. Fire store konfigurasjoner av tett patch-klemme teknikken har vært utviklet ¹¹; celle-vedlagt, innsiden ut, på utsiden ut og hele celle oppdateringen. De tre første konfigurasjonene brukes vanligvis for enkelt ion kanal undersøkelser. For det fjerde, etter celle tilknyttet konfigurasjonen, er hull i cellemembranen fremstilt med sub atmosfærisk trykk. Denne konfigurasjonen tillater også undersøkelser av ion kanal sammensetningen av hele cellen ¹². Imidlertid er en begrensning av denne teknikken at cytoplasmatiske molekyler er utvannet av oppdateringen pipette løsning ¹³ (figur 1A), noe som påvirker de elektriske og fysiologiske responser av studerte celler. Faktisk kan noen av disse molekyler spille viktige roller i Albin på signalet eller regulering av ulike ionekanaler. For å unngå dette, utviklet Lindau og Fernandez ¹⁴ en metode der en pore-forming sammensatt legges til oppdateringen pipette. Etter celle tilknyttet konfigurasjonen, sammensatte vil innlemme i plasma membranen under oppdateringen og sakte autoperforering membranen lage elektrisk kontakt med stoffer (figur 1B). Du kan bruke flere ulike antifungals som nystatin ¹⁵ og amfotericin B ¹⁶eller tensider som saponin beta-escin ^17,18 . Disse forbindelser opprette porene stor nok monovalent kasjon og Cl^– spredning mellom stoffer og patch pipette samtidig bevare cytosolic nivåene av makromolekyler og større ioner som Ca^{2 + 15, 16}.

Utfordringen med å bruke perforert oppdateringen er potensielt høy serien motstanden. Serien motstand (R_s) eller access motstand er motstand oppdateringen Pipetter i forhold til bakken. Under oppdateringen-klemme innspillinger, R_s vil være parallelt med membran motstand (R_m). R_m og R_s i parallell arbeid som en spenning skillelinjen. Med høy R_s, faller spenningen over R_s gir feil i opptak. Feilen blir større med større strøm registrert. I tillegg er spenning delelinjen også frekvens avhengige oppretter et low pass-filteret, noe som påvirker timelige oppløsningen. Faktisk kan perforert oppdateringen ikke alltid tillate opptak av stor og raskt strømninger som spenningen gated Na⁺ strøm (for detaljerte lesninger se referanse ¹⁹). Også variere R_s under oppdateringen-klemme innspillinger, igjen fører til endringer i registrert gjeldende. Dermed oppstå falske positiver i situasjoner der R_s endres under medikament programmet.

Elektrofysiologi på skiver vevet ble først introdusert av Andersen lab å studere elektrofysiologiske kjennetegner nervecellene i hjernen ²⁰. Teknikken banet vei for detaljert enkeltceller i tillegg til celle-celle kommunikasjon og celle kretser i et mer intakt miljø. En lignende teknikk for å lage hypofysen stykker ble introdusert i 1998 av Guérineau et al. ²¹. det var imidlertid ikke før 2005 at hjernen-hypofysen skive forberedelse ble brukt med hell i patch-klemme studier i teleost ²². I denne studien rapportert forfatterne også bruk av perforerte patch-klemme innspillinger. Imidlertid langt, er de fleste av elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler utført i pattedyr, og bare en håndfull andre virveldyr, inkludert teleost fisk ^1,2,22,23 . I teleoster, ble nesten alle studier utført på primære dissosiert celler ^{24,25,26,27,28,29,30} .

I dagens papir skissere vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av sunn hjernen-hypofysen skiver fra modellen fisk medaka. Tilnærmingen representerer flere fordeler sammenlignet med primære dissosiert cellekulturer. Først registreres cellene i et relativt bevart miljø forhold til avstand celle kultur forhold. Andre tillate skive forberedelser oss å studere indirekte trasé formidlet av celle-celle kommunikasjon ²², hvilke er ikke mulig i dissosiert celle kultur forhold. Videre viser vi hvordan man skal gjennomføre elektrofysiologiske opptak innhentet vev skiver med perforert hele celle patch-klemme teknikken amfotericin B som pore-forming agent.

Medaka er en liten fisk i Asia hovedsakelig funnet i Japan. Den fysiologi, embryologi og genetikk av medaka har blitt grundig studert for over 100 år ³¹, og det er en vanligvis anvendt forskning modell i mange laboratorier. Spesielt viktig å dette papiret er forskjellige morfologiske organiseringen av hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: mens pattedyr og fugler av hypothalamus nevroner løslate deres Nevro-hormoner som regulerer hypofysen endokrine celler i portal system på medianen eminense er det en direkte nervøse projeksjon av hypothalamus nevroner på endokrine cellene i hypofysen i teleost fisk ³². Dermed er nøye gjennomført hjernen-hypofysen kutting av særlig betydning fisk, slik at vi kan undersøke elektrofysiologiske kjennetegner hypofysen cellene i et godt bevart hjernen-hypofysen, og spesielt hvordan hypofysen celler kontrollere deres excitability og dermed Ca^{2 +} homeostase.