L’ipofisi è un organo endocrino chiave nei vertebrati situati sotto l’ipotalamo e posteriormente al chiasma. Produce e secerne ormoni di sei-otto dai tipi cellulari specifici. Ormoni ipofisari costituiscono un intermedio tra il cervello e gli organi periferici e pilotare un’ampia gamma di processi fisiologici essenziali tra cui la crescita, la riproduzione e la regolazione dell’omeostasi. Simili ai neuroni, cellule endocrine dell’ipofisi sono eccitabili elettricamente con la capacità di fuoco spontaneamente i potenziali di azione ¹. Il ruolo di questi potenziali di azione è cella dipendente. In diversi tipi di cellule dell’ipofisi dei mammiferi, i potenziali di azione possono elevare l’intracellulare Ca^{2 +} sufficientemente per un rilascio prolungato dell’ormone ². Inoltre, l’ipofisi riceve informazioni sia stimolatori e inibitori del cervello che colpisce il potenziale di membrana delle cellule ^3,4,5,6. In genere, stimolatori input aumenta l’eccitabilità e spesso comporta il rilascio di Ca^{2 +} dai depositi intracellulari nonché aumentata frequenza ⁷di infornamento. Comprendere come la cella utilizza la composizione di canale ionico e si adatta a questi segnali di input dal cervello è la chiave alla comprensione dell’ormone sintesi ed il rilascio.

La tecnica del patch-clamp è stata sviluppata nel tardo 1970 da Sakmann e Neher ^8,9,10 e ulteriormente migliorata da Hamill ¹¹e permette indagini dettagliate delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule giù per i canali ionici singolo. Inoltre, la tecnica può essere utilizzata per lo studio di tensione e corrente. Oggi, patch di bloccaggio è il gold standard per le proprietà elettrofisiologiche della cella di misura. Quattro configurazioni principali della tecnica del patch-clamp tenuta sono stati sviluppati ¹¹; la cella collegata, dentro-fuori, fuori-fuori e la patch di cellule intere. Le tre configurazioni prime in genere sono utilizzate per le indagini di canale singolo ione. Per il quarto, dopo la configurazione di cella-associata, un buco nella membrana cellulare avviene tramite pressione sub-atmosferica. Questa configurazione consente inoltre di indagini della composizione canale ionico dell’ intera cellula ¹². Tuttavia, una limitazione di questa tecnica è che molecole citoplasmatiche sono diluiti dai patch pipetta soluzione ¹³ (Figura 1A), influenzando così le risposte elettriche e fisiologiche delle cellule studiate. Infatti, alcune di queste molecole possono svolgere ruoli importanti nella trasduzione del segnale o nella regolazione dei canali ionici diversi. Per evitare questo, Lindau e Fernandez ¹⁴ ha sviluppato un metodo dove un composto pore-forming viene aggiunto alla pipetta patch. In seguito la configurazione collegata alla cella, il composto sarà incorporare nella membrana del plasma sotto la patch e lentamente perforare la membrana creazione contatto elettrico con il citosol (Figura 1B). Parecchi diversi antimicotici quali nistatina ¹⁵ e amfotericina B ¹⁶, o tensioattivi come le saponine beta-escina ^17,18 possono essere utilizzato. Questi composti creare pori abbastanza grandi da permettere di cationi monovalenti e Cl^– diffusione tra il citosol e la pipetta patch preservando i livelli citosolici di macromolecole e più grandi ioni come Ca^{2 + 15, 16}.

La sfida di utilizzare perforato patch è la resistenza serie potenzialmente elevato. Resistenza in serie (R_s) o accesso resistenza è la resistenza combinata sopra la pipetta patch rispetto al suolo. Durante le registrazioni di patch-clamp, la R_s sarà in parallelo con la resistenza di membrana (R_m). R_m e R_s a lavoro parallelo come un partitore di tensione. Con l’alta R_s, la tensione cadrà sopra la R_s dà errori nelle registrazioni. L’errore diventerà più grande con correnti elevate registrate. Inoltre, il partitore di tensione è anche frequenza dipendente dalla creazione di un filtro passa-basso, influenzando così la risoluzione temporale. In effetti, la patch perforata potrebbe non sempre consentire registrazioni delle ampie e veloci correnti come la tensione gated le correnti Na⁺ (per letture dettagliate vedi riferimento ¹⁹). Inoltre, R_s possono variare durante le registrazioni di patch-clamp, nuovamente portando a cambiamenti nella corrente registrata. Così, falsi positivi possono verificarsi in situazioni dove R_s cambia durante l’applicazione del farmaco.

L’elettrofisiologia sul tessuto affettato è stato introdotto al laboratorio di Andersen per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni nel cervello ²⁰. La tecnica ha aperto la strada per indagini dettagliate delle singole cellule così come i circuiti di comunicazioni e cellula-cellula in un ambiente intatto. Una tecnica simile per fare fette pituitari è stato introdotto nel 1998 da Guérineau et al. ²¹. Tuttavia, non era prima del 2005, quella fetta di cervello-ipofisi preparazione è stata utilizzata con successo per gli studi di patch-clamp in teleostei ²². In questo studio, gli autori hanno segnalato anche l’utilizzo di registrazioni perforato patch clamp. Tuttavia, di gran lunga, la maggior parte delle indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie sono stati condotti nei mammiferi e solo una manciata di altri vertebrati, tra cui pesci teleostei ^1,2,22,23 . In teleostei, quasi tutti gli studi sono stati effettuati su cellule dissociate primarie ^{24,25,26,27,28,29,30} .

Nel presente documento, abbiamo delineare un protocollo ottimizzato per la preparazione di fette di cervello-ipofisi sane da medaka di pesce il modello. L’approccio rappresenta diversi vantaggi rispetto alle colture primarie di cellule dissociate. In primo luogo, le cellule vengono registrate in un ambiente relativamente conservato rispetto al dissociato condizioni di coltura delle cellule. In secondo luogo, fetta preparazioni ci permettono di studiare percorsi indirette mediate dalla cella comunicazione ²², che non è possibile in condizioni di coltura delle cellule dissociate. Inoltre, dimostriamo come condurre le registrazioni elettrofisiologiche sulle fette di tessuto ottenuti usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp con amfotericina B come l’agente pore-forming.

Medaka è un piccolo pesce d’acqua dolce originario dell’Asia, trovato principalmente in Giappone. La fisiologia, embriologia e genetica di medaka è stata studiata estesamente per oltre 100 anni ³¹, ed è un modello di ricerca comunemente utilizzati in molti laboratori. Di particolare importanza per questa carta è l’organizzazione morfologica distinta del complesso ipotalamo-ipofisario nei pesci Teleostei: considerando che nei mammiferi e uccelli i neuroni ipotalamici rilasciano loro neuro-ormoni che regolano le cellule endocrine ipofisarie nel sistema portale dell’eminenza mediana, c’è una proiezione nervosa diretta dei neuroni ipotalamici sulle cellule endocrine dell’ipofisi in pesci teleostei ³². Così, attentamente condotta cervello-ipofisi affettare è di particolare importanza nei pesci, che ci permette di studiare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in una rete di cervello-ipofisi ben conservata e cellule in particolare come ipofisi controllare loro eccitabilità e quindi omeostasi del Ca^{2 +} .