Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern ¹. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca^{2 +} ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons ²erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen ^3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca^{2 +} von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz ⁷feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.

Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher ^8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill ¹¹, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten ¹¹; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle ¹². Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung ¹³ (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez ¹⁴ eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin ¹⁵ und Amphotericin B ¹⁶oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin ^17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl^– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca^{2 + 15zu ermöglichen, 16}.

Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-_s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-_s werden parallel mit Membran-Widerstand (R_m). R_m und R_s in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-_s, fällt die Spannung über die R-_s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na⁺ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz ^{19 Siehe}) R_s kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo R_s während der Zulassungsantrag ändert.

Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn ²⁰zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. ²¹. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost ²²erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische ^{1,2,22,23 durchgeführt} . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen ^{24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt.} .

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- ²², das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.

Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren ³¹ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische ³². Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca^{2 +} Homöostase.