Hypofysen er en vigtige endokrine orgel i hvirveldyr placeret under hypothalamus og posteriort for den optiske chiasm. Det producerer og udskiller seks til otte hormoner fra de specifikke celletyper. Hypofyse hormoner udgør en mellemting mellem hjernen og perifere organer og køre en lang række væsentlige fysiologiske processer, herunder vækst, reproduktion og reguleringen af homeostase. Svarende til neuroner, endokrine celler af hypofysen er elektrisk overgearet med evnen til at fyre handling potentialer spontant ¹. Rollen, som disse handling potentialer er celle afhængige. I flere celletyper af pattedyr hypofysen, kan handling potentialer løfte den intracellulære Ca^{2 +} tilstrækkeligt til en vedvarende frigivelse af hormonet ². Derudover modtager hypofysen både stimulerende og hæmmende oplysninger fra hjernen, der påvirker membranen potentiale celler ^3,4,5,6. Typisk, stimulerende input øger ophidselse og ofte indebærer frigivelsen af Ca^{2 +} fra intracellulære butikker samt øget fyring frekvens ⁷. Forstå, hvordan cellen udnytter ion-kanal sammensætning og tilpasser sig disse input signaler fra hjernen er nøglen til forståelse hormon syntese og frigivelse.

Patch-clamp-teknik blev udviklet i slutningen af 1970 ‘ erne af Sakmann og Neher ^8,9,10 og yderligere forbedret ved Hamill ¹¹, og giver mulighed for detaljerede undersøgelser af elektrofysiologiske egenskaber af celler ned til enkelt Ionkanaler. Teknikken kan desuden bruges til at studere både strøm og spænding. I dag, er patch-fastspænding guld standard for måling af elektrofysiologiske egenskaber af cellen. Fire store konfigurationer af tæt forsegling patch-clamp-teknik har været udviklede ¹¹; celle-attached, indefra og ud, udenfor-out og hele-cell-patch. De tre første konfigurationer bruges typisk til enkelt ion-kanal undersøgelser. For det fjerde, efter den celle-attached konfiguration, er et hul i cellemembranen lavet ved hjælp af sub atmosfærisk tryk. Denne konfiguration giver også mulighed for undersøgelser af ion-kanal sammensætning af hele cellen ¹². En begrænsning af denne teknik er imidlertid at cytoplasmatisk molekyler udvandes af den patch pipette løsning ¹³ (fig. 1A), hvilket påvirker de elektriske og fysiologiske reaktioner i de undersøgte celler. Faktisk, nogle af disse molekyler kan spille en vigtig rolle i transduktion af signalet eller regulering af forskellige Ionkanaler. For at undgå dette, udviklet Lindau og Fernandez ¹⁴ en metode, hvor en poreformede sammensatte føjes til patch pipette. Efter den celle-attached konfiguration, vil sammensat indarbejde i plasma membranen under patch og langsomt perforere membran skabe elektrisk kontakt med cytosol (figur 1B). Flere forskellige svampemidler såsom nystatin ¹⁵ og amphotericin B ¹⁶eller overfladeaktive stoffer såsom saponin beta-escin ^17,18 kan bruges. Disse forbindelser oprette porer stor nok til at tillade monovalent kationer og Cl^– diffusion mellem cytosol og patch pipette samtidig bevare de cytosole niveauer af makromolekyler og større ioner som Ca^{2 + 15, 16}.

Udfordringen ved hjælp af perforeret patch er potentielt høje serie modstand. Serien modstand (R_s) eller adgang modstand er den samlede modstand over patch pipette i forhold til jorden. Under patch-clamp optagelser, Rasmussen_s vil være parallelt med membran modstand (R_m). R_m og R_s i sideløbende arbejde som en spænding skillevæg. Med høj Rasmussen_s, vil spændingen falder over R_s give fejl i optagelserne. Fejlen vil blive større med større strømme registreres. Spænding skillevæg er derudover også frekvens afhænger af, at skabe en lav-pass filter, således påvirke den tidsmæssige opløsning. I realiteten kan den perforerede patch ikke altid muligt at optagelser af store og hurtige strømninger som spændingen gated Na⁺ strømme (for detaljeret aflæsninger Se reference ¹⁹). Også, Rasmussen_s kan variere under patch-clamp optagelser, igen fører til ændringer i den registrerede aktuelle. Således er kan falske positiver opstå i situationer hvor R_s ændringer under stof ansøgning.

Elektrofysiologi på skiver væv blev introduceret af Andersen lab at studere elektrofysiologiske egenskaber af neuroner i hjernen ²⁰. Teknikken, der banede vejen for detaljerede undersøgelser af enkelt celler samt celle-celle kommunikation og celle kredsløb i en mere intakt miljø. En lignende teknik til at gøre hypofyse skiver blev indført i 1998 af Guérineau et al. ²¹. det var dog ikke før 2005, at hjernen-hypofyse skive forberedelse blev brugt med succes til patch-clamp undersøgelser i teleost ²². I denne undersøgelse rapporterede forfatterne også brugen af perforeret patch-clamp optagelser. Men langt de fleste af de elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet ført i pattedyr, og kun en håndfuld andre hvirveldyr, herunder teleost fisk ^1,2,22,23 . I teleosts, blev næsten alle undersøgelser udført på primære dissocierede celler ^{24,25,26,27,28,29,30} .

I det foreliggende papir skitsere vi en optimeret protokol for forberedelse af sund hjerne-hypofyse skiver fra model fisk medaka. Metoden repræsenterer flere fordele i forhold til primære dissocierede cellekulturer. Først, registreres cellerne i et relativt konserveret miljø i forhold til dissocieres celle kultur betingelser. Andet, Skive præparater tillade os at studere indirekte veje medieret af celle-celle kommunikation ²², som er ikke muligt i dissocierede celle kultur betingelser. Desuden demonstrere vi, hvordan man gennemføre elektrofysiologiske optagelser på de opnåede væv skiver med perforeret hele-celle patch-clamp-teknik med amphotericin B som poreformede agent.

Medaka er en lille ferskvandsfisk native til Asien, især findes i Japan. Fysiologi, embryologi og genetik af medaka er blevet grundigt undersøgt for over 100 år ³¹, og det er et almindeligt anvendt forskning model i mange laboratorier. Af særlig betydning for dette dokument er de forskellige morfologiske organisation af hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: boer i pattedyr og fugle af hypothalamus neuroner frigive deres neuro-hormoner regulerer hypofysens endokrine celler ind i den portal systemet af medianen eminence er der en direkte nervøs projektion af hypothalamus neuroner på de endokrine celler af hypofysen i teleost fisk ³². Således er nøje gennemført hjerne-hypofyse udskæring af særlig betydning i fisk, så vi kan undersøge elektrofysiologiske egenskaber af hypofyse cellerne i et velbevaret hjerne-hypofyse-netværk, og især hvordan hypofyse celler styre deres ophidselse og dermed Ca^{2 +} homøostase.