垂体是脊椎动物的主要内分泌器官, 位于下丘脑下和视神经交叉后。它产生和分泌六到八荷尔蒙从特定细胞类型。垂体激素是大脑和周围器官之间的一种中间体, 它推动了一系列重要的生理过程, 包括生长、繁殖和调节稳态。与神经元相似, 垂体内分泌细胞具有自发激发动作电位¹的电兴奋能力。这些动作电位的作用是细胞依赖。在哺乳动物垂体的几种细胞类型中, 动作电位可以使细胞内钙含量提高^{2 以上}, 以持续释放荷尔蒙²。此外, 垂体从大脑中得到刺激和抑制信息, 影响细胞^{3、4、5、6}的细胞膜电位。通常情况下, 刺激输入会增加兴奋性, 并且经常涉及从胞内存储中释放 Ca^{2 +}以及增加射击频率⁷。了解细胞如何利用离子通道组成, 并适应这些输入信号从大脑是了解激素合成和释放的关键。

二十世纪七十年代下旬, Sakmann 和内尔^8、9、10和哈米尔¹¹进一步改进了膜片钳技术, 并允许对细胞的电生理特性进行详细的研究。单离子通道。此外, 该技术还可用于研究电流和电压。今天, 贴片夹紧是衡量细胞电生理特性的金标准。四密密封贴片钳技术主要配置¹¹;细胞连接, 内而外, 外出, 和整个细胞补丁。三第一种配置通常用于单离子通道调查。第四, 在细胞连接配置后, 细胞膜上的一个孔是利用亚大气压进行的。这种配置还允许对整个单元¹²的离子通道组成进行调查。然而, 这种技术的一个局限性是, 细胞质分子是稀释的膜片吸管溶液¹³ (图 1A), 从而影响的电学和生理反应的研究细胞。事实上, 其中一些分子可能在信号传导或不同离子通道的调节中扮演重要角色。为了避免这种情况, 林道和费尔南德斯¹⁴开发了一种方法, 将孔隙形成的化合物添加到贴片吸管中。根据细胞连接的配置, 该化合物将并入等离子膜下的补丁和慢慢穿孔的膜创建电接触细胞质 (图 1B)。几种不同的抗真菌药物, 如制霉菌素¹⁵和两性霉素 B ¹⁶, 或表面活性剂, 如皂苷β-七叶皂素^17,18可以使用。这些化合物创造足够大的毛孔, 允许在细胞质和贴剂之间进行单价阳离子和 Cl 扩散, 同时保持大分子和更大的离子如 Ca^{2 + 15}的胞浆水平^{, 16}。

使用穿孔补丁的挑战是潜在的高串联电阻。串联电阻 (R_s) 或接触电阻是相对于地面的贴片吸管的联合电阻。在膜片钳录音中, r_s将与膜电阻 (r_m)平行。r_m和 r_s并行工作, 作为一个电压分配器。随着高 r_s,电压将下降的 r_s给错误的录音。随着更大的电流记录, 错误将变得更大。此外, 分压器还依赖于频率依赖性的创建低通滤波器, 从而影响时间分辨率。实际上, 穿孔补丁可能并不总是允许大和快速电流的记录, 如电压门控 Na⁺电流 (详细读数见参考¹⁹)。另外, R_s在补丁钳录音期间可能变化, 再导致记录的当前的变动。因此, 在药物应用过程中 R 变化的情况下, 可能发生误报。

安徒生实验室首先介绍了切片组织的电生理学, 以研究脑²⁰中神经元的电生理特性。该技术为在更完整的环境中对单细胞以及细胞通讯和细胞电路的详细研究铺平了道路。1998年 Guérineau 了一种类似的制作垂体切片的技术. ²¹. 然而, 2005年之前, 脑-垂体切片制剂已成功用于硬骨鱼类²²的膜片钳研究。在本研究中, 作者还报告了使用穿孔膜片钳录音。然而, 到目前为止, 大多数垂体细胞的电生理研究都是在哺乳动物中进行的, 只有少数其他脊椎动物, 包括硬骨鱼类鱼^1,2,22,23.在硬骨鱼类, 几乎所有的研究都在主要的离解细胞^{24,25,26,27,28,29,30 进行}.

本文概述了从模型鱼鳉中制备健康脑-垂体切片的优化方案。与原代分离细胞培养相比, 该方法具有多种优点。首先, 与分离细胞培养条件相比, 细胞在相对保存的环境中被记录下来。第二, 切片制剂使我们能够研究细胞通讯介导的间接通路²², 这在分离细胞培养条件下是不可能的。此外, 我们还演示了如何使用多孔全细胞膜片钳技术, 以两性霉素 B 为成孔剂, 对获得的组织切片进行电生理记录。

鳉是原产于亚洲的一条小型淡水鱼, 主要见于日本。鳉的生理、胚胎学和遗传学研究已有100年的³¹, 是许多实验室中常用的研究模式。本文特别重视硬骨鱼类鱼下丘脑-垂体复合体的形态学组织: 而在哺乳动物和鸟类中, 下丘脑神经元释放其调节垂体内分泌细胞的神经激素。进入中位隆起的门系统, 有一个直接的神经投射到下丘脑神经元的内分泌细胞的垂体在硬骨鱼类鱼³²。因此, 仔细进行脑-垂体切片在鱼类中尤为重要, 使我们能够研究保存完好的脑-垂体网络中垂体细胞的电生理特性, 特别是垂体细胞如何控制他们的兴奋性, 从而 Ca^{2 +}稳态。