Summary

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

Published: June 26, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo’s en de methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Dit is een gemakkelijke en snelle procedure om te controleren van genexpressie tijdens de ontwikkeling die ook kan worden toegepast op weefselsecties, organen of gekweekte cellen.

Abstract

De Escherichia coli LacZ gen, codering van β-galactosidase, wordt grotendeels gebruikt als verslaggever voor de expressie van genen en als een tracer in cel lineage studies. De klassieke histochemische reactie is gebaseerd op de hydrolyse van het substraat X-gal in combinatie met ijzer(III) en ferro ionen, die een onoplosbare blauwe neerslag die gemakkelijk produceert te visualiseren. Daarom, β-galactosidase-activiteit dient als een marker voor het patroon van de uitdrukking van het gen van belang aangezien de ontwikkeling te werk gaat. Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo’s en de latere methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Bovendien is voorzien in een procedure voor de verduidelijking van de hele embryo’s aan X-gal kleuring dieper de regio, van de embryo beter te visualiseren. Consistente resultaten worden verkregen door het uitvoeren van deze procedure, hoewel optimalisatie van omstandigheden nodig is om te minimaliseren van achtergrond activiteit. Beperkingen in de bepaling moeten ook worden overwogen, met name met betrekking tot de grootte van het embryo in het hele mount kleuring. Onze protocol biedt een gevoelige en een betrouwbare methode voor de detectie van de β-galactosidase tijdens de ontwikkeling van de muis die verder kan worden toegepast op de cryostaat secties, evenals de hele organen. Dus de dynamische gen expressiepatronen in de gehele ontwikkeling kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van dit protocol in hele embryo’s, maar ook gedetailleerde expressie op het cellulaire niveau kan worden beoordeeld na paraffine segmenteren.

Introduction

Om specifiek gen expressiepatronen beschrijven, is het gebruik van verslaggever genen als markeringen primordiaal van Drosophila tot zoogdieren geweest. In proeven met dieren van transgene en knockout, is het bacteriële β-galactosidase-gen (LacZ) van Escherichia coli (E. coli) één van de wijdst gebruikte1,,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyseert de hydrolyse van β-galactosides (zoals lactose) in haar monosacchariden (glucose en galactose)5. Zijn meest gebruikte substraat is X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een glycoside dat is gehydrolyseerd door β-galactosidase schadeveroorzakende in 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole en galactose. De eerste wordt geoxideerd tot een dimeer omgezet die, wanneer gebruikt in combinatie met kalium ferri- en ferro-cyanide, produceert een karakteristieke onoplosbare, blauwe kleur neerslag (Figuur 1)6.

Het LacZ -gen begon te worden gebruikt als een verslaggever gen meer dan dertig jaar geleden7,8. Meestal, LacZ is ingebracht stroomafwaarts van een endogene promotor in de plaats van de open leesraam, zodat het kan worden gebruikt in bacteriële en cel cultuur te visualiseren van cellen met een bepaalde invoegen, evenals in transgene dieren als een tracer van endogene Genetische expressiepatronen tijdens ontwikkeling9. In dit verband is de visualisatie van β-galactosidase-activiteit uitgebreid gebruikt in Drosophila te begrijpen van de ontwikkelings- en cellulaire processen van afzonderlijke cellen tot hele weefsels. Drosophila genetica gunst de generatie van stabiele lijnen waarin een gemodificeerde constructie van de P-element met het gen van de verslaggever dat lacz is ingevoegd op willekeurige locaties in het genoom. Dus, wanneer geplaatst onder invloed van enhancer elementen kan hij haar expressie rijden op een specifieke wijze van weefsel, waardoor een systematische analyse van de expressiepatronen van veel genen tijdens de afgelopen twee decennia10. Verder staat het gebruik van transgene muizen LacZ genuitdrukking controleren ook detectie van gene recombinatie gebeurtenissen door Cre-loxP gemedieerde recombinatie en lokalisatie van de mutant embryonale stamcellen derivaten in chimeer analyses 11, die de controle van LacZ expressie in specifieke weefsels zo goed als stoffelijk vergemakkelijkt. Ook in hele embryo’s, kan detectie van de β-galactosidase-activiteit produceren differentiële kleuring patronen bij verschillende intensiteiten die gemakkelijk kunnen worden waargenomen in de verschillende ontwikkelingsstadia te analyseren van tijdelijke wijzigingen in genexpressie 8,12.

In dit artikel presenteren we een protocol om te visualiseren van genexpressie via X-gal vlekken in het weefsel van de hele berg op vroege ontwikkelingsstadia van muis embryo’s. Wij presenteren deze histochemische methode als een zeer gevoelige en goedkope techniek die nauwkeurige detectie van de gelabelde cellen in de hele berg specimens of op cellulair niveau gunsten nadat paraffine-weefsels of embryo’s ingebedde. De methode geschikt is voor de directe visualisatie van vlekken in het weefsel van de muis met de minimale achtergrond in vergelijking met andere methoden13.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) en de Comunidad Autónoma de Madrid om minimale dierenleed. 1. verzamelen van embryo’s van zwangere muizen (van E8.5 naar E12.5) Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie of CO2 inademing. De dag van de eerste waargenomen vaginale plug werd beschouwd als embryonale dag 0,5 (E0.5). Leg het d…

Representative Results

Hier tonen we de resultaten van de toepassing van het standaardprotocol voor de β-galactosidase histochemische reactie met behulp van X-gal als het substraat in hele muis embryo’s (Figuur 1 en Figuur 2). Met behulp van dit protocol, onderzoeken we membraan type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) expressie op verschillende embryonale ontwikkelingsstadia (E9.5, E11.5 en E12.5) met behulp van Mt4-mmp mutant muizen die uitdrukking…

Discussion

Het LacZ-gen van E. coli is wijd verbeid gebruikt als verslaggever in studies van gen-expressiepatronen vanwege de hoge gevoeligheid en gebruiksgemak detectie. Dit protocol beschrijft een klassieke methode voor het opsporen van β-gal expressie gebaseerd op een enzymatische reactie die is eenvoudig en snel uit te voeren en goedkoop. Deze methode kan ook worden toegepast zonder belangrijke wijzigingen in de hele berg embryo’s, intact organen, cryostaat weefselsecties of gekweekte cellen.

<p class="jove_conten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedank de histopathologische Service voor hun technische bijstand bij het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Wij danken ook Dr. Motoharu Seiki voor vriendelijk bieden Mt4-mmpLacZ muizen, en Dr. Alicia G. Arroyo om ons project te steunen en voor haar kritische lezing van het manuscript. Wij wensen Peter Bonney dank voor dit artikel proeflezen. Dit werk werd gesteund door Universidad Europea de Madrid door middel van een subsidie uit (# 2017UEM01) aan CSC

Materials

REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24×60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

References

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Play Video

Cite This Article
Blanco, M. J., Learte, A. I., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

View Video