Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer
Summary
Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og metoden for parafin snitting og counterstaining. Dette er en enkel og rask prosedyre å overvåke genuttrykk under utvikling som kan også brukes til vev deler, organer eller kulturperler celler.
Abstract
Escherichia coli LacZ genet, koding β-galactosidase, brukes hovedsakelig som en reporter for genuttrykk og en tracer i celle avstamning studier. Klassisk histochemical reaksjonen er basert på hydrolyse av underlaget X-gal i kombinasjon med ferric og jern ioner, som produserer en uløselig blå bunnfall som er lett å visualisere. Derfor fungerer β-galactosidase aktivitet som en markør for uttrykket mønsteret av genet av interesse som utviklingen fortsetter. Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og påfølgende metoden for parafin snitting og counterstaining. I tillegg tilbys en prosedyre for å avklare hele embryo bedre visualisere X-gal flekker i dypere områder av fosteret. Konsekvente resultater er oppnådd ved å utføre denne prosedyren, selv om optimalisering av reaksjonen forhold er nødvendig for å minimere bakgrunn aktivitet. Begrensninger i analysen bør også vurderes, spesielt om størrelsen av embryoet i hele mount flekker. Våre protokollen gir en følsom og en pålitelig metode for påvisning av β-galactosidase under musen utvikling som kan brukes mer kryostaten deler samt hele organer. Dermed dynamisk genet uttrykk mønstre gjennom utvikling enkelt kan analyseres ved hjelp av denne protokollen i hele embryoer, men også detaljert uttrykk på cellenivå kan vurderes etter parafin snitting.
Introduction
For å beskrive spesifikke genet uttrykk mønstre, er bruk av reporteren gener som markører viktig fra Drosophila for pattedyr. Eksperimenter med transgene og knockout dyr, er bakteriell β-galactosidase genet (LacZ) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest brukte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) gir hydrolyse av β-galactosides (for eksempel laktose) i monosaccharides (glukose og galaktose)5. Det mest brukte underlaget er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycoside som er hydrolyzed av β-galactosidase gir opphav til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galaktose. Først er oksidert i således en dimer som, når kombinert med kalium ferri- og ferro-cyanid, produserer en karakteristisk uløselig, blått utløse (figur 1)6.
LacZ genet begynte å bli brukt som en reporter genet over tretti år siden7,8. Vanligvis LacZ settes nedstrøms en endogen formidler stedet åpent lesing rammen, slik at den kan brukes i bakteriell og cellen kultur visualisere cellene som inneholder en bestemt setter og transgene dyr som en tracer av endogene Gene expression mønstre under utvikling9. I denne forbindelse har visualisering av β-galactosidase aktivitet vært mye brukt i Drosophila for å forstå de utviklingsmessige og cellulære prosessene fra enkeltceller hele vev. Drosophila arvelighetsforskning favorisere generering av stabil linjer som en endret P-element konstruksjon som inneholder reporter genet LacZ er satt inn tilfeldig steder i genomet. Dermed når plassert under påvirkning av enhancer elementer kan det drive sitt uttrykk i en vev bestemt måte, som har tillatt systematisk analyse av uttrykk mønstre av mange gener i løpet av de siste to tiår10. I tillegg kan bruken av transgene mus å overvåke LacZ genuttrykk også påvisning av genet rekombinasjon hendelser etter grobunn-loxP mediert rekombinasjon, og lokalisering av mutant embryonale stamcelleforskningen derivater i chimeric analyser 11, som forenkler kontroll av LacZ uttrykk i bestemte vev også som timelig. Også i hele embryoer, kan oppdagelsen av β-galactosidase aktivitet produsere differensial flekker mønstre på forskjellige intensiteter som enkelt kan observeres over forskjellige utviklingsstadier analysere tidsmessige endringer i genuttrykk 8,12.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å visualisere genuttrykk gjennom X-gal flekker i hele mount vev på tidlig i utviklingen etapper av mouse embryoer. Vi presenterer denne histochemical metoden som en svært følsom og billig teknikk som favoriserer nøyaktig påvisning av merket cellene i hele mount prøver eller på cellenivå etter parafin innebygd vev eller embryoer. Metoden tillater direkte visualisering av flekker i musen vevet med minimum bakgrunnen sammenlignet med andre metoder13.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli LacZ genet har vært mye brukt som reporter i studier av genet uttrykk mønstre på grunn av dens høy følsomhet og enkel oppdagelsen. Nåværende protokollen beskriver en klassisk metode for å oppdage β-gal uttrykk basert på en enzymatisk reaksjon som er raskt og enkelt å utføre og billig. Denne metoden kan brukes også uten store endringer i hele mount embryo, intakt organer, kryostaten vev deler eller kulturperler celler.
Nøyaktig anvendelse av denne metoden resulter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Histopathological tjenesten for deres kundestøtte på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for vennlige gi Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo for å støtte vårt prosjekt og hennes kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å takke Peter Bonney for korrekturlesing av denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av Universidad Europea de Madrid med stipend (# 2017UEM01) til C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
