Summary

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

Published: September 13, 2018
doi:

Summary

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

성인 포유류 척수에서 신경 줄기 세포 (NSCs)는 공부 생체 외에서 neurosphere 분석 결과 사용 하 여 될 수 있는 뇌 세포의 상대적으로 mitotically 무부하 인구. 이 식민지 형성 분석 결과 접시;에 외 인 요인 NSCs의 반응을 하는 강력한 도구 그러나,이 또한 힘의 적당 한 이해 및 분석 결과의 한계 vivo에서 조작의 효과 연구를 사용할 수 있습니다. 임상 관심의 한 조작 생 NSC 활성화에 상해의 영향 이다. 척수 상해의 현재 모델 제공이 줄기 세포가 있는 상해의 사이트에 NSC 틈새의 파괴를 일으킬 하는 일반적인 타 박상, 압축, 및 transection 모델의 심각도 공부에 대 한 도전. 여기, 우리는 성인 마우스 척수의 낮은 흉부 수준 (t 7/8)의 표면 dorsolateral 표면에 지역화 된 손상을 초래 하는 최소한의 부상 모델을 설명 합니다. 이 부상 모델 상해의 수준에서 중앙 운하를 예비 하 고 부상에 따라 다양 한 시간 지점에서 병 변의 수준에 있는 NSCs의 분석 합니다. 여기, 우리가 어떻게 neurosphere 분석 결과 척수 뇌 영역-기본 및 최종 NSCs에 있는 NSCs의 두 개의 별개, 직계-관련, 인구의 활성화 연구에 이용 될 수 있다 표시 (pNSCs와 dNSCs, 각각). 상해 및 백색 질 부상 사이트의 수준에서 뇌 영역에서 이러한 NSCs 문화를 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 수술 후 척수 해 우리의 pNSC 및 부상된 코드 컨트롤, 상해를 통해 그들의 활성화를 말하기에 비해 뇌 영역에서 dNSC에서 파생 된 neurospheres의 증가 수 보여줍니다. 또한, 부상, 다음 dNSC에서 파생 된 neurospheres 격리 될 수 있습니다 부상 사이트에서-상해의 사이트에 그들의 뇌 틈새에서 마이그레이션할 NSCs의 능력을 보여주는.

Introduction

중앙 신 경계 모든 다른 성숙한 신경 세포 유형1,2,,34를 수 있는 자체 갱신, multipotent 줄기 세포의 부분 모집단을 포함 되어 있습니다. 이러한 신경 줄기 세포 (NSCs) 뇌와 척수에서 전문된 틈새에 있으며 증식, 마이그레이션, 성숙한 신경 세포로 분화 하는 부상에 따라 활성화 될 수 있다. NSCs 및 그들의 자손 대뇌 피 질의 부상 모델5,6부상 사이트로 마이그레이션할 표시 되었습니다. 두뇌에 있는 NSCs 측면 심에서 그들은 이다 glial 흉터 대형7을에 분화 상해의 사이트에 마이그레이션할 표시 되었습니다. 그러나 척수,, 몇 가지 연구 수행 되었습니다 다음 척수 상해 회복을 촉진 하이 같은 생 NSCs를 다룰 수 있습니다 경우에 게. 실제로, 현재 논쟁이 있다 활성화는 척수에 줄기 세포 수영장의 중앙 운하8 안 감 뇌 틈새의 직접적인 물리적 손상에 필요한 지 여부 또는 경우는 척추에 손상을 코드 실질 (줄기를 떠나 그대로 셀 틈새)은 생 NSCs9활성화 충분 합니다.

척수 상해 (SCI) 모델의 수는 급성과 만성 부상의 병 태 생리학을 공부 하 이용 되었다. 이 모델 또한 neuroprotection, immunomodulation, 개발 세포 이식/대체 전략10,,1113를 통해 SCI를 치료에 잠재적인 치료를 테스트에 사용 되었습니다. 현재 모델에는 코드14,15에서 대규모 기능적인 적자 뿐 아니라 광범위 한 병 변 및 현상을 일으킬 압축 및 타 박상 부상 포함 됩니다. 결과 glial 흉터는 대부분 척수16의 너비/둘레의 함께 여러 척추 세그먼트를 확장할 수 있습니다. 따라서, 이러한 모델은 임상 관련, 그들은 줄 부상 다음 생 NSCs의 응답을 공부 하 고 중요 한 과제. 중앙 채널17을 마련할 수 있는 상해의 온화한 형태를 적용할 수 있습니다 부상의 화학 모델을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 이러한 유형의 부상 demyelination SCI와 관련 된에 초점을 하 고 하지 임상 관련 모델 외상 문화와 관련 된 물리적 또는 기계적 손상에 대 한

현재 부상 모델의 한계를 해결 하기 위해 우리는 바늘 트랙 최소한의 과학 모델, 원래는 쥐9, 성인 마우스 모델에서 응용 프로그램에 대 한 개발을 적응 시켰다. 우리의 적응된 부상 모델 마우스 척수의 dorsolateral 지역의 일관 된 병 변을 만들 수 있으며 상해의 수준에 중앙 운하 예비. 이 모델의 장점은 NSC 속도 론 연구 허가 상해 및 그들의 잠재적인 방사형 마이그레이션 상해의 사이트에 다음. 마우스 모델의 사용 또한 생 NSCs와 부상에 따라 그들의 자손의 혈통 추적을 허용 하는 유전자 변형 마우스의 사용을 허용 합니다. 생체 외에서 neurosphere 분석 결과이 프로토콜에 도입의 수정 된 양식을 사용 하 여 NSCs의 속성 평가 추가 수 있습니다.

Neurosphere 분석 결과 생체 외에서 식민지 형성 분석 결과 mitogens 존재 NSCs의 격리를 허용 하는. 클론 도금 밀도에서 개별 NSCs NSCs의 작은 부분 모집단 및 창시자18,19의 대부분의 구성 하는 셀의 부동성 구형 식민지를 확산. 우리의 프로토콜에서 척수의 뇌 영역에서 두 개의 별개, 직계 관련 NSCs의 설명-초기 조건 하에서 그리고 우리의 최소한의 과학 모델에 따라. 확실 한 신경 줄기 세포 (dNSCs) 익스프레스 nestin 및 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)와 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 및 헤 파 린 (함께 불리 EFH)20의 성장 된다. 이러한 dNSCs 거의 neurospheres에 시험관에게 상승을 주는 순진한 척수에 드물다. 그러나, 우리는 dNSCs 다음 최소한의 과학, 뇌 지역21에서 분리 된 neurospheres의 숫자를 확대 활성화 됩니다 보여줍니다. 기본 신경 줄기 세포 (pNSCs)은 신경 줄기 세포 계보에서 dNSCs의 업스트림. pNSCs의 pluripotency 마커 Oct4, 상당히 드문, 익스프레스 저급 고 백혈병 금지 요인 (LiF) 응답22. pNSCs neurospheres 주 문화;에 있는 myelin 기본적인 단백질 (MBP)의 존재로 인해 성인 마우스 척수에서 격리 때 형성 하지 않는다 그러나, pNSC neurospheres MBP 결핍 생쥐에서 격리 될 수 있습니다 및 그들의 숫자는 확장된 다음 부상-dNSCs21비슷합니다. 마지막으로, 우리 보여 dNSC에서 파생 된 neurospheres 일찍 최소한의 영향은 다음 번에 상해에의 사이트에서 고립 될 수 있다 이러한 결과 우리의 부상 모델 및 분석 실험 그들의 능력을 확산 하 고 부상에 대 한 응답에서 마이그레이션할 같은 뇌 NSCs의 활성화 특성을 평가할 수 있습니다 보여 줍니다.

Protocol

이 프로토콜 토론토 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 “가이드에는 관리 및 사용의 실험 동물”은 (2차 버전, 동물 관리에 캐나다 위원회 2017). 1. 최소한의 척수 상해 수술 참고: 수술 전에 있는지 확인 하십시오 모든 수술 기구와 자료 (그림 1A)는 적절 한 방법으로 살 균 된다. 거 즈의 4-5 사각형을 고…

Representative Results

수술, 다음 쥐 꼬리와 최대 24 h에 대 한 가능한 뒷 다리 사지 paresis 포함할 수 있는 최소 모터 적자를 경험 한다. 이 시간 후 쥐 뒷 다리 사지 마비 또는 paresis 없고 걸음 걸이에서 최소한의 변화를 경험 한다. 그림 3 에서 5 일 최소한의 척수 상해 neurosphere 분석 결과에서 대표적인 결과 보여줍니다. DNSC에서 ?…

Discussion

외과 절차 동안 어디 연구원 동물 사이 가변성을 최소화 하 고 최적의 결과 얻기에 특히 주의 기울여야 한다 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 해야 합니다 주의 (isoflurane) 흡입된 마 취와 수술 중 마 취 장기간된 노출27와 신경 보호 효과를 표시 되었습니다로. 따라서, 부상에 따라 척수의 재생 능력, 공부를 할 때 신속 하 고 혼란 변수를 방지 하기 위해 가능한 한 효율적으로 수술을 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 Krembil 재단 (운영 보조금 CMM)에 의해 자금을. WX 칼튼 마가렛 스미스 학생 상 받는 했다. NL는 온타리오 대학원 장학금을 받았다.

Materials

Agricola Retractor Fine Science Tools 17005-04
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) Fine Science Tools 15370-50 Customize when ordering to get blunted tips
Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) Fine Science Tools 11152-10 Or any other forceps for suturing
Hartman Hemostats (Straight) Fine Science Tools 13002-10 Or any other appropriate for suturing
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Or any other appropriate
Hair clippers amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA or any other appropriate
Stereotaxic instrument Stoeling 51500 or any other appropriate
Buprenorphine or any appropirate sanctioned my animal care facility
Meloxicam or any appropriate sanctioned by animal care facility
Tears Naturale P.M. Alcon https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE or any other appropriate
Isoflurane Baxter International Inc DIN 02225875 or any other appropriate for anesthesia
Q-tips Cottom Swabs amazon.ca https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze Fisher Scientific 13-761-52
30G Needles Becton Dickinson 305106 For Injury
25G Needles Becton Dickinson 305122 For Drug injections
1mL Syringes Becton Dickinson 3090659 for drug injections
3mL Syringes Becton Dickinson 309657 for fluid injections
4-0 Suture uoftmedstore.com 2297-VS881 for skin suturing
6-0 Suture uoftmedstore.com VS889 for muscle suturing
Polysporin ointment amazon.ca 102051
Isoflurane Vaporizer VetEquip 901806
15mL conical tubes ThermoFisher Any appropriate
Petri Dishes ThermoFisher any appropriate
Trypan Blue ThermoFisher Any
Hemocytometer ThermoFisher Any appropriate
Centrifuge ThermoFisher Any appropriate
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000
Counting Microscope Olympus CKX41
Neural Basal-A Medium Invitrogen 10888-022
B27 Invitrogen 17404-044
Penicillin- Streptomycin Gibco 15070
L- Glutamine Gibco 25030
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 12700075
30% Glucose Sigma G6152 1M- 9.01g in 100mL dH2O
1M Glucose
7.5% NaHCO3 Sigma S5761 155mM- 1.30g in 100mL dH2O
155mM NaHCO3
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g in 100mL dH2O
Apo-Transferrin R&D Systems 3188-AT
Putrescine  Sigma P7505
Insulin Sigma I5500
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Papain Dissociation System  Worthington Biochemical Corporation PDS 1 vial of papain can be used for 2 samples
Epidermal Growth Factor Invitrogen PMG8041 Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Fibroblast Growth Factor Invitrogen PHG0226 Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Heparin Sigma H3149
Leukemia Inhibitory Factor In House
Trypan Blue
Hemocytometer
24 well Plates NUNC
2M NaCl Sigma S5886 11.69g in 100mL dH2O
1M KCL Sigma P5405 7.46g in 100mL dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33g in 100mL dH2O
108mM CaCl2 Sigma  C7902 1.59g in 100mL dH2O

References

  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. 神经科学. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  26. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  27. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  28. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Play Video

Cite This Article
Lakshman, N., Xu, W., Morshead, C. M. A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (139), e57727, doi:10.3791/57727 (2018).

View Video