Summary

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

Interazioni ospite-microbo intestino sono stati valutati utilizzando un approccio innovativo che unisce una comunità orale sintetica, la digestione gastrointestinale in vitro e un modello dell’epitelio dell’intestino tenue. Presentiamo un metodo che può essere adattato per valutare l’invasione delle cellule degli agenti patogeni e multispecie biofilm, o anche per testare la capacità di sopravvivenza dei probiotici formulazioni.

Abstract

L’interazione tra host e microbiota è stato a lungo riconosciuto e ampiamente descritto. La bocca è simile ad altre sezioni del tratto gastrointestinale, come microbiota residente si verifica e impedisce la colonizzazione di batteri esogeni. Infatti, più di 600 specie di batteri si trovano nella cavità orale, e un singolo individuo può trasportare circa 100 diversi in qualsiasi momento. I batteri orali possiedono la capacità di aderire alle varie nicchie nell’ecosistema orale, così diventando integrato all’interno della comunità microbica residente e favorire crescita e sopravvivenza. Tuttavia, il flusso di batteri nell’intestino durante la deglutizione è stato proposto a perturbare l’equilibrio del microbiota. Infatti, la somministrazione orale di p. gingivalis spostato composizione batterica nella microflora ileale. Abbiamo usato una comunità sintetica come una rappresentazione semplificata dell’ecosistema naturale orale, per delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. Quattordici specie sono stati selezionati, sottoposti in vitro salivare, gastrica e processi di digestione intestinale e presentati a un modello di vari compartimenti cellulari contenenti cellule Caco-2 e HT29-MTX per simulare l’epitelio della mucosa intestinale. Questo modello ha servito a svelare l’impatto di ingestione batteri su cellule coinvolte nella circolazione enteroepatica. Uso delle Comunità di sintetiche permette di controllabilità e riproducibilità. Così, questa metodologia può essere adattata per valutare la vitalità del patogeno e successive modifiche associate all’infiammazione, capacità di colonizzazione delle miscele di probiotici, e in ultima analisi, batterico potenziale impatto sulla circolazione presistemica.

Introduction

Gli esseri umani convivono con i batteri, che sono presenti presso lo stesso numero di cellule umane1. Quindi, è di fondamentale importante ottenere una comprensione globale del microbioma umano. La cavità orale è un ambiente unico, in quanto è diviso in parecchi più piccoli habitat, contenendo così una grande varietà di batteri e biofilm in quei luoghi diversi. Essendo un ecosistema aperto, alcune specie in bocca può essere transitori visitatori. Tuttavia, alcuni microrganismi colonizzano presto dopo la nascita e forma organizzata biofilm2. Questi si trovano sulla superficie dei denti sopra il crepaccio gengiva, subgingival interstiziale, linguetta, superfici mucose e protesi dentali e materiali da otturazione3. I batteri possono essere presenti anche come flocculi e cellule planctoniche nel lume del canale del dente, intervallate da tessuto della polpa necrotica o sospeso in una fase fluida.

C’è attivo, continuo cross-talk tra cellule dell’ospite e il microbiota residente4. Batteri comunicano all’interno e tra le specie, e solo una piccola percentuale dei colonizzatori naturale possa aderire ai tessuti, mentre altri batteri allegare Questi colonizzatori primari. Per esempio, l’associazione di cella tra microrganismi è essenziale per integrare colonizzatori secondari nel biofilm orali e costruzione di reti complesse di interazione cellule microbiche4. Circa il 70% degli aggregati batterici in un campione di saliva sono formate da Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e non identificato Bacteroidetes. F. nucleatum è un colonizzatore intermedio nel biofilm subgengivale e aggregati con i colonizzatori tardi gingivalis del p., T. denticola e Tannerella forsythia, che sono implicati in periodontitis5. In più, Streptococcus mitis occupa habitat sia mucoso e dentale, mentre S. sanguinis e S. gordonii preferiscono colonizzare denti3. Così, S. sanguinis è presente in incisivi inferiori e canini, mentre Actinomyces naeslundii è stato trovato in anteriori superiore6.

Inoltre, il microbioma indigeno svolge un ruolo nel mantenimento della salute umana2. Microbiota residente partecipa alla formazione immune e nell’impedire l’espansione di agente patogeno. Questa resistenza di colonizzazione si verifica perché i batteri nativi possono essere meglio adattati al fissaggio su superfici e più efficienti a metabolizza le sostanze nutritive disponibili per la crescita. Sebbene ceppi probiotici sopravvivono al passare gastrointestinale e rimangono attive, la persistenza di batteri autoctoni inghiottito da una posizione superiore del tratto gastrointestinale non è stato completamente descritto. Così, abbiamo sottoposto una comunità artificiale, rappresentante dell’ecosistema orale, alle condizioni di transito gastrointestinale simulata. Attuabilità delle cellule batteriche è stata valutata utilizzando un modello multicomparto che assomiglia l’epitelio intestinale. Simulatori di intestino attuale offrono riproducibilità adatto in termini di analisi della comunità microbica luminal7. Tuttavia, adesione batterica e l’interazione ospite-microbo separatamente sono indirizzate, come combinazione di linee cellulari con comunità microbiche è impegnativo8. Al contrario, vi presentiamo un quadro che fornisce spiegazione meccanicistica potenziale di colonizzazione successo eventi segnalati sull’interfaccia dell’intestino. Infatti, questo modello può essere congiuntamente utilizzato con un modello statico dell’intestino per valutare l’impatto delle comunità microbiche su host superficie segnalazione.

Protocol

1. ceppi e condizioni della coltura Nota: La comunità orale sintetica è stata composta da ceppi comunemente presenti in microbioma orale3. Ottenere i seguenti ceppi da americano tipo Culture Collection (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus <…

Representative Results

Questo protocollo conduce alla generazione di un modello adatto di delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. I conteggi delle cellule intatte da singoli ceppi è di circa 108 cellule mL-1 prima della creazione della Comunità sintetica, mentre il microcosmo multispecifica contenuto superiore al 90% di cellule vitali durante la creazione di comunità ( Figura 1A</st…

Discussion

Il microbioma orale è un elemento chiave nella salute umana, come recentemente riportato da diversi autori20,21. I risultati precedenti suggeriscono che l’ingestione di saliva che contiene grandi carichi di batteri può influenzare l’ecosistema microbico dell’intestino tenue, che è uno dei principali siti per l’adescamento immune. La combinazione di un modello statico di digestione gastrointestinale superiore con l’interfaccia host rappresentato dalle cellule e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca Fiandre a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria è un postdoctoral fellow supportato da Flanders innovazione e imprenditorialità (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).

Materials

STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture Collection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture Collection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture Collection ATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture Collection ATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture Collection ATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture Collection ATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture Collection ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria Collection LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture Collection ATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 86010202
HT29-MTX cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 12040401
REAGENTS AND CONSUMABLES
Brain Heart Infusion (BHI) broth Oxoid CM1135
Blood Agar 2 Oxoid CM0055 Blood Agar medium
Menadione Sigma M9429
Hemin Sigma H9039
5% sterile defibrinated horse blood E&O Laboratories Ltd, P030
InnuPREP PCRpure Kit Analytik Jena 845-KS-5010250 PCR purification kit
Big Dye Applied Biosystems 4337454 Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems 4337456
SYBR Green I Invitrogen S7585
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile VWR 734-2311
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Trypan Blue solution
0.4%, liquid, sterile-filtered
Sigma-Aldrich T8154 
PBS Gibco 14190250
DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate Life technologies 31966-047
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3450-24EA
Mucin from porcine stomach Type II   Sigma-Aldrich M2378
Inactivated fetal bovine serum Greiner Bio One 758093
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Triton X 100 for molecular biology Sigma-Aldrich T8787 
DPBS without calcium, magnesium Gibco 14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm Corning Costar Corp 3450
Nuclease-free water Serva Electrophoresis 28539010
EQUIPMENT
Neubauer counting chamber improved Carl Roth T729.1
BD Accuri C6 Flow cytometer BD Biosciences 653118
PowerLyzer 24 Homogenizer MoBio 13155
T100 Thermal Cycler BioRad 186-1096
Flush system Custom made
InnOva 4080 Incubator Shaker New Brunswick Scientific 8261-30-1007 Shaker for 2.10
Memmert CO2 incubator Memmert GmbH & Co. ICO150med
Millicell ERS (Electrical Resistance System) EMD Millipore, Merck KGaA MERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system Millipore, Merck KGaA
Shaker (ROCKER 3D basic) IKA 4000000 Shaker for 6.10

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Cite This Article
Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele, T., Hernandez-Sanabria, E. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (137), e57699, doi:10.3791/57699 (2018).

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