Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Het baanbrekende werk van Gordon et al. in 1980 bleek dat de injectie van de plasmide-DNA in de mannelijke pronuclei van bevruchte eicellen na implantatie bij pseudopregnant muizen, de productie van transgene dieren die geïntegreerd kan opleveren de plasmide DNA¹. De demonstratie dat transgene zoogdieren kunnen worden gegenereerd gehad een enorme impact op de wereldwijde biowetenschappen, openen de weg naar nieuwe velden van onderzoek zowel voor basiswetenschappen en translationeel Biomedische Wetenschappen. In de afgelopen vier decennia, is DNA microinjection een gangbare praktijk geworden. Hoewel een enorm aantal transgene muizen zijn vervaardigd, wordt de standaardmethode is niet volledig bruikbaar voor alle muis stammen en vereist tijdrovend backcrosses^2,3. De toepassing ervan op andere soorten nog steeds uitdagend⁴ en de algehele transgenic integratie opbrengst is beperkt tot een paar percentage van geboren dieren⁵. Bovendien, betekent de werkzaamheid van transgenic integratie de beperkende factor die het slechte algehele rendement van pronuclear DNA injection verklaart. In dit opzicht, integratieve virale vectoren zijn de meest efficiënte gereedschappen om lading en integreren van transgenen en dus kon voorzien in nieuwe middelen aanzienlijk te verhogen integratie opbrengst, de enige beperking is dat de transgenic grootte die niet hoger zijn dan 10 kb⁶ .

Lentivirale vectoren pseudo-getypte met de envelop eiwitten van het Virus van vesiculaire Stomatitis (VSV) zijn pantropic en zeer integrative gene transfer tools en kunnen worden gebruikt om de bevruchte eicellen⁷transduce. De zona zitten rond de eicellen is een natuurlijke virus barrière en moet worden doorgegeven zodat transductie met de lentivirale vectoren. Transgene dieren zijn gegenereerd door transducing bevruchte eicellen na micro-boren of verwijderen van de zona zitten^8,9. Echter, injectie onder de zona zitten in de perivitelline ruimte lijkt de eenvoudigste methode om de bevruchte eieren zoals oorspronkelijk beschreven door Lois en collega’s⁷transduce.

De perivitelline injectie van lentivirale vectoren kan hoge opbrengsten in de productie van transgene dieren die boven de 70% van de geboren dieren. Deze opbrengst is meer dan 10-fold hoger zijn dan het beste rendement dat kan worden bereikt met behulp van standaard pronuclei DNA injectie^7,10,11. In deze context zal één sessie van injecties ten minste 50 transgene oprichters (F0) genereren. Het grote aantal oprichters compatible, dus met fenotypering van het effect van de transgenic rechtstreeks uitgevoerd op F0 Muizen zonder de noodzaak voor het genereren van transgene muis lijnen. Dit voordeel zorgt voor een snelle screening van het transgenic effect en is speciaal aangepast voor het uitvoeren van in vivo winst en verlies van functie studies binnen weken. Daarnaast kunnen regelgevende DNA-elementen ook worden snel gescreend om kaart smaakversterkers en DNA motieven gebonden transcriptie factoren^11,12. Met pronuclear injecties integreren transgenen meestal als meerdere exemplaren in een unieke locus. Met lentivirale vectoren, integratie in meerdere loci treedt op als een enkel exemplaar per locus^10,13. De veelheid van geïntegreerde loci daarom waarschijnlijk geassocieerd met de zeer hoge expressie doordringendheid waargenomen in de transgene stichters, waardoor de nieuw gegenereerde model robuuster.

Nog belangrijker is, bij het gebruik van pronuclear injectie van DNA, is visualisatie van pronuclei tijdens de procedure absoluut vereist. Deze technische beperking voorkomt het gebruik van de bevruchte eicellen die afkomstig zijn uit een grote verscheidenheid van stammen van de muis. Dus, de productie van een transgene model in een bepaalde stam voor welke pronuclei zijn onzichtbaar de productie van dieren in een tolerante stam gevolgd door ten minste 10 opeenvolgende backcrosses vereist overdracht van de transgenic in de gewenste muis stam. Met de lentivirale vector injecties, perivitelline ruimte is altijd zichtbaar en de injectie niet vereist zeer specifieke vaardigheden. Als voorbeeld, zijn knik/SCID transgene muizen die niet geschikt voor pronuclei injectie zijn verkregen met de virale vector injecties¹⁴.

Hier is een uitgebreide protocol gepresenteerd zodat eenvoudige productie van transgene muizen met behulp van lentivirale vector injecties in de ruimte van de perivitelline van een embryo van de fase één cel. Transgenic expressie gecontroleerd met een alomtegenwoordige of cel specifieke initiatiefnemers wordt in detail beschreven.

De ΔU3 van de lentivirale backbone van pTrip werd gebruikt in deze studie¹⁵. Deze vector kan voor het produceren van replicatie defecte lentivirale vectoren waarin de volgorde van de U3 is gedeeltelijk verwijderd om te verwijderen van de U3 promotor activiteit en het genereren van een zelf inactivating vector (SIN)¹⁶. Lentivirale vector voorraden werden geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK-293T cellen met de p8.91 inkapseling plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, de codering van de vesiculaire stomatitis virus (VSV) glycoproteïne-G¹⁷, en de pTRIP-ΔU3 pHCMV-G recombinante vector. De gedetailleerde productie-procedure wordt hier geboden als aanvullende methoden.

Productie van hoge titer lentivirale vector voorraden wordt uitgevoerd onder Biosafety Level II voorwaarden (BSL-2). Dit geldt voor de meeste transgenen met uitzondering van oncogenen die moeten worden geproduceerd in BSL-3. Daarom is de productie in BSL-2 voorwaarden voor de meeste gevallen voldoende. Bovendien, zijn het gebruik en de productie meestal verbroken voor de meeste nationale regelgevende instanties die zich bezighouden met genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s). Beperkte hoeveelheid replicatie incompetent SIN lentivirale vectoren (onder 2 µg p24 Eiwitmantel eiwit) kunnen worden gebruikt onder BSL-1 voorwaarden zoals beschreven door de Franse GGO-Agentschap in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Unie.