Summary

Explorant le Microbiome racine : extraire les données de la communauté bactérienne du sol, rhizosphère et racine endosphère

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir des données de séquence amplicon du sol, la rhizosphère et racine endosphère microbiomes. Cette information peut être utilisée pour étudier la composition et la diversité des communautés microbiennes associées aux plantes et est adaptée pour l’utilisation avec un large éventail d’espèces végétales.

Abstract

L’interaction intime entre la plante hôte et les microorganismes associés est cruciale dans la détermination de remise en forme de plante et peut favoriser l’amélioration de la tolérance aux stress abiotiques et aux maladies. Le microbiome usine peut être très complexes et à faible coût, haut débit méthodes telles que l’amplicon basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16 s sont souvent préférées pour caractériser sa composition microbienne et sa diversité. Toutefois, le choix d’une méthodologie appropriée lorsqu’il procède à de telles expériences est essentiel pour réduire les préjugés qui peuvent compliquer l’analyse et des comparaisons entre les études et les échantillons. Ce protocole décrit en détail une méthode normalisée pour la collecte et l’extraction de l’ADN d’échantillons de sol, rhizosphère et racine. En outre, nous mettre en évidence un pipeline bien établi 16 s rRNA amplicon séquençage qui permet l’exploration de la composition des communautés bactériennes dans ces échantillons et peut facilement être adaptées pour d’autres gènes marqueurs. Ce gazoduc a été validé pour une variété d’espèces de plantes, y compris le sorgho, le maïs, blé, fraise et agave et peut aider à surmonter les problèmes associés à la contamination des organelles de la plante.

Introduction

Associées aux plantes microbiomes se composent des communautés microbiennes dynamiques et complexes, composées de bactéries, archées, virus, champignons et autres micro-organismes eucaryotes. Outre leur rôle bien étudié en provoquant des maladies des plantes, associées aux plantes microbes peuvent également influencera phytosanitaire en améliorer la tolérance aux stress biotiques et abiotiques, promouvoir la disponibilité des nutriments et l’amélioration de la croissance des plantes par le biais la production des phytohormones. Pour cette raison, un intérêt particulier existe pour caractériser les taxons qui associent à la plante racine endosphères, rhizosphères et le sol environnant. Alors que certains microbes peuvent être cultivés dans un isolement sur milieux généré de laboratoire, beaucoup ne peuvent pas, en partie parce qu’ils peuvent compter sur des relations symbiotiques avec d’autres microbes, poussent très lentement, ou nécessitent des conditions qui ne peuvent pas être répliquées dans un environnement de laboratoire. Parce qu’il contourne la nécessité pour la culture et est relativement peu coûteux et haut-débit, profilage phylogénétique basé sur séquence d’échantillons microbiens environnementaux et liés à l’hôte est devenue une méthode de choix pour doser la communauté microbienne composition.

La sélection des technologies de séquençage approprié fourni par divers prochaine génération séquençage (NGS) plates-formes1 repose sur les besoins des utilisateurs, avec des facteurs importants dont : couverture désirée, longueur de l’amplicon, attendu communautaire diversité, ainsi que le séquençage de taux d’erreur, lire-la longueur et le coût-par-run/megabase. Une autre variable qui doit être examinée dans les expériences de séquençage axée sur l’amplicon est quels gènes seront amplifiés et quelles amorces seront utilisés. Lors de la conception ou choix d’amorces, chercheurs sont souvent contraints d’opérer compromis entre l’universalité de l’amplification et la résolution taxonomique réalisable depuis les amplicons qui en résulte. Pour cette raison, ces types d’études choisi souvent des amorces et des marqueurs qui ciblent sélectivement des sous-ensembles spécifiques du microbiome. Évaluation de la composition des communautés bactériennes est couramment exécutée par séquençage un ou plusieurs des régions hypervariables des bactérienne 16 s rRNA gene2,3. Dans cette étude, les auteurs décrivent un amplicon basé le séquençage protocole développé pour une plate-forme NGS région du gène de l’ARNr 16 s bactérienne, qui permet une amplification large de taxons bactériens tout en offrant une variabilité suffisante pour cibles les 500 bp V3-V4 distinguer les différents taxons. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour l’utilisation avec d’autres paires d’amorces, telles que celles qui visent le marqueur ITS2 de champignons ou de la sous-unité d’ARNr 18 s des eucaryotes.

Tandis que d’autres approches comme fusil métagénomique, metatranscriptomics et séquençage des unicellulaires, offrent des autres avantages notamment résolu de génomes microbiens et une mesure plus directe de la fonction communautaire, ces techniques sont généralement plus cher et par le calcul intensif que le profilage phylogénétique décrites ici4. En outre, exécutant fusil métagénomique et metatranscriptomics sur des échantillons de racines donne un pourcentage élevé de lectures appartenant au génome de la plante hôte, et des méthodes pour contourner cette limitation sont toujours développés5,6.

Comme avec n’importe quelle plateforme expérimentale, axée sur l’amplicon profilage peut introduire un certain nombre de biais potentiels qui doivent être considérés lors de l’analyse de données et la conception expérimentale. Il s’agit de méthodes de prélèvement d’échantillons ADN extraction, choix des amorces de PCR et comment la préparation de la bibliothèque est effectuée. Différentes méthodes peuvent avoir un impact significativement la quantité de données utilisables générées et peuvent aussi entraver les efforts visant à comparer les résultats entre les études. Par exemple, la méthode d’élimination de bactéries rhizosphère7 et l’utilisation de techniques d’extraction différente ou choix de DNA extraction kits8,9 montrent significativement en aval l’étude d’impact, ce qui conduit à conclusions différentes concernant les microbes sont présents et leur abondance relative. Étant donné que le profilage basé sur amplicon peut être personnalisé, faire des comparaisons entre les études peut être difficile. La terre Microbiome Project a suggéré que les chercheurs qui étudient les systèmes complexes comme le microbiome associées aux plantes bénéficieraient de l’élaboration de protocoles normalisés comme un moyen d’atténuer la variabilité causée par l’application de différentes méthodes entre études10,11. Ici, nous discutons beaucoup des thèmes ci-dessus et approprié de présenter des propositions quant à où les meilleures pratiques.

Le protocole montre le processus de collecte de sol rhizosphère et échantillons de racines de Sorghum bicolor et extraction ADN à l’aide d’un kit isolement d’ADN bien établi11. En outre, notre protocole inclut un flux de travail de séquençage détaillé amplicon, utilisant une plate-forme NGS couramment utilisée, pour déterminer la structure des communautés bactériennes12,13,14. Ce protocole a été validé pour l’usage dans une large gamme de plantes-hôtes dans une récente étude publiée des racines, rhizosphère et associés-les sols de 18 espèces de monocotylédones dont Sorghum bicolor, Zea mays et Triticum aestivum15. Cette méthode a également été validée pour être utilisé avec d’autres gènes marqueurs, comme en témoigne son application réussie à l’étude du gène de marqueur ITS2 fongique dans les études de l’agave microbiome16,17 et fraise microbiome 18.

Protocol

1. collecte et séparation des racines endosphère, la rhizosphère et des échantillons de sol Avant d’entrer dans le champ, l’eau ultrapure (au moins 90 mL d’eau par exemple) autoclave pour stériliser. Préparer, tampon de retrait épiphyte (au moins 25 mL par exemple) en ajoutant 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g K2HPO4et 1 mL de Triton X-100, à 1 L d’eau stérile. Stériliser le tampon à l’aide d’un filtre à vide avec 0.2 µm taille de pores. Pour l…

Representative Results

Exécutant le protocole recommandé devrait se traduire par un ensemble de données indexées lectures jumelé-fin qui peut être assorti à chaque échantillon et assignés à une ou l’autre bactérienne des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) ou une séquence exacte variante (ESV, également dénommé amplicon variante de séquence (ASV) et sub-operational unité taxonomique (sOTU)), selon l’analyse en aval. Afin d’obtenir des données sur les séquences de haute qualité,…

Discussion

Ce protocole montre un pipeline établi pour explorer la racine endosphère, la rhizosphère et compositions de communauté microbienne du sol, de l’échantillonnage sur le terrain pour le traitement des échantillons et le séquençage en aval. Experimentation microbiomes associés à racine présente des difficultés particulières, dû en partie aux difficultés inhérentes à l’échantillonnage du sol. Les sols sont très variables en fonction des propriétés physiques et chimiques, et les différentes condition…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par l’USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS est pris en charge par le programme de bourses en recherche universitaire NSF.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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