Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere
Summary
Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.
Abstract
La interacción íntima entre la planta huésped y microorganismos asociados es crucial en la determinación de aptitud de la planta y puede fomentar mejor tolerancia a estreses abióticos y enfermedades. Como el microbioma de la planta puede ser muy compleja y de bajo costo, alto rendimiento métodos tales como secuenciación basada en productos del gene del rRNA 16S se prefieren a menudo para caracterizar su composición microbiana y diversidad. Sin embargo, la selección de la metodología adecuada al llevar a cabo tales experimentos es fundamental para reducir los sesgos que se pueden hacer análisis y comparaciones entre las muestras y estudios difíciles. Este protocolo describe en detalle una metodología estandarizada para la colección y extracción de ADN de muestras de suelo, rizósfera y raíz. Además, destacar una tubería bien establecida 16S rRNA amplicon secuencia que permite la exploración de la composición de comunidades bacterianas en las muestras y puede ser fácilmente adaptados para otros genes marcadores. Este gasoducto ha sido validado para una gran variedad de especies de plantas, incluyendo sorgo, maíz, trigo, fresa y agave y puede ayudar a superar problemas asociados con la contaminación de los organelos de la planta.
Introduction
Microbiomes asociada a la planta consisten en dinámicas y complejas de las comunidades microbianas de bacterias, arqueas, virus, hongos y otros microorganismos eucariotas. Además de su función bien estudiado como causa de enfermedad de plantas, microbios asociados planta pueden influir también positivamente en sanidad vegetal por mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos, promover la disponibilidad de nutrientes y mejorar el crecimiento de las plantas a través de la producción de fitohormonas. Por esta razón, existe particular interés en la caracterización de los taxa que se asocian con la planta raíz endospheres, rhizospheres y el suelo circundante. Mientras que algunos microbios pueden ser cultivadas en aislamiento en laboratorio generado medios de comunicación, muchos no pueden, en parte porque puede depender de relaciones simbióticas con otros microorganismos, crecen muy lentamente, o requieren condiciones que no pueden repetirse en un entorno de laboratorio. Porque evita la necesidad de cultivo y es relativamente barato y de alto rendimiento, perfiles filogenéticos basados en la secuencia de muestras ambientales y asociado anfitrión microbianas ha convertido en un método preferido para el análisis de la comunidad microbiana composición.
La selección de tecnologías de secuenciación adecuada proporcionada por varios generación sequencing (NGS) plataformas1 depende de las necesidades del usuario, con factores importantes como: la cobertura deseada, longitud del amplicón, espera que la comunidad diversidad, así como tasa de error, lectura de longitud y el costo-por-run/megabase de secuenciación. Otra variable que debe considerarse en los experimentos de secuenciación basada en productos es lo que gene se amplificarán y qué iniciadores se utilizará. Al diseñar o elegir cebadores, los investigadores a menudo se ven obligados a hacer realizables de los amplicones resultante entre la universalidad de la amplificación y la resolución taxonómica. Por esta razón, este tipo de estudios eligió a menudo cartillas y marcadores dirigidos selectivamente a subconjuntos específicos de la microbioma. Evaluación de la composición de comunidades bacterianas comúnmente se logra ordenando uno o más de las regiones hipervariables de bacteriano 16S rRNA gene2,3. En este estudio, describimos un amplicon basado en protocolo de secuenciación desarrollado para una plataforma NGS esa región de bp V3-V4 de objetivos el 500 del gene del rRNA 16S bacteriano, que permite la amplificación amplia de taxones bacterianos mientras que también proporciona suficiente variabilidad para distinguir entre diferentes taxones. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el uso con otros conjuntos de la cartilla, como los dirigidos al marcador ITS2 de hongos o la subunidad rRNA de 18S de los eucariotas.
Mientras que otros enfoques tales como metagenómica de escopeta, metatranscriptomics y secuenciación unicelular, ofrecen otras ventajas incluyendo genomas microbianos resueltos y medición más directa de la función de la comunidad, estas técnicas son generalmente más caro y cálculo intensivo de los perfiles filogenéticos describen aquí4. Además, realizar escopeta metagenómica y metatranscriptomics en muestras de raíz produce un gran porcentaje de lecturas que el genoma de la planta huésped, y métodos para superar esta limitación todavía están siendo desarrollados5,6.
Como con cualquier plataforma experimental, basada en productos de perfiles pueden introducir a una serie de sesgos potenciales que deben considerarse en el análisis de datos y diseño experimental. Estos incluyen los métodos de recogida de muestras ADN extracción, selección de iniciadores PCR, y cómo se realiza la preparación de la biblioteca. Diferentes métodos pueden afectar significativamente la cantidad de datos utilizables generados y también pueden obstaculizar los esfuerzos para comparar resultados entre estudios. Por ejemplo, el método de eliminación de bacterias de rizósfera7 y el uso de técnicas de extracción diferentes o elección de ADN de8,de kits de extracción9 han demostrado a un impacto significativo en análisis posteriores, que conduce a conclusiones diferentes sobre cuáles microbios están presentes y su abundancia relativa. Desde perfiles basados en los productos pueden ser modificado para requisitos particulares, puede ser difícil hacer comparaciones entre los estudios. El proyecto del microbioma de tierra ha sugerido que los investigadores estudiando sistemas complejos como el microbioma asociado de planta beneficiaría el desarrollo de protocolos estándares como un medio de reducir al mínimo la variabilidad causada por la aplicación de diferentes métodos entre los estudios10,11. Aquí, discutimos muchos de los temas mencionados y ofrecen sugerencias sobre las mejores prácticas de donde proceda.
El protocolo muestra el proceso de recoger muestras de suelo, rizósfera y raíz de Sorghum bicolor y extracción del ADN mediante un ADN bien establecida aislamiento kit11. Además, nuestro protocolo incluye un flujo de trabajo de la secuencia detallada de productos, utilizando una plataforma NGS comúnmente utilizada, para determinar la estructura de las comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo ha sido validada para el uso en una amplia gama de anfitriones de la planta en un reciente estudio publicado de las raíces, rizosfera y asociados-suelos de 18 especies de monocotiledóneas, incluyendo sorgo bicolor, Zea mays y Triticum aestivum15. Este método también ha sido validado para su uso con otros genes marcadores, como lo demuestra su exitosa aplicación al estudio de los hongos ITS2 gen marcador en estudios de agave microbioma16,17 y microbioma fresa 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo muestra una tubería establecida para explorar endosphere raíz, rizosfera y composiciones de comunidad microbiana del suelo, del muestreo de campo para el procesamiento de las muestras y la secuenciación descendente. Microbiomes asociada a raíz de estudiar presenta desafíos únicos, debido en parte a las dificultades inherentes en el muestreo de suelo. Suelos altamente variable en términos de propiedades físicas y químicas, y diferentes condiciones de suelo pueden ser separadas por tan sólo unos mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS es apoyado por el programa de becas de postgrado investigación de NSF.
Materials
| 0.1-10/20 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-3810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000027 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes | Eppendorf | 3120000909 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 100 µL multi-channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 1000 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1122-1830 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 2 mm soil sieve | Forestry Suppliers | 60141009 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 200 µL filtered micropipette tips | USA Scientific | 1120-8810 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 25 mL reservoirs | VWR International LLC | 89094-664 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 50 mL conical vials | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| 500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| 96-well microplates | USA Scientific | 655900 | |
| 96-well PCR plates | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instructions for use: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf |
| Aluminum foil | Boardwalk | 7124 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Analytical scale with 0.001 g resolution | Ohaus Pioneer | PA323 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Bioruptor Plus ultrasonicator | Diagenode | B01020001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811000908 | Including 50mL and 96-well plate bucket adapters |
| Cryogenic gloves | Millipore Sigma | Z183490 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| DNeasy PowerClean kit (optional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Previously MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Previously MoBio |
| Dry ice | Any | NA | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Do not substitute |
| Ethanol | VWR International LLC | 89125-188 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gallon size freezer bags | Ziploc | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Gemini EM Microplate Reader | Molecular Devices | EM | Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lab coat | Workrite | J1367 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 | Any | NA | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Liquid N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Milli-Q ultrapure water purification system | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuge | Eppendorf | 5404000014 | |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Mortars | VWR International LLC | 89038-150 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Nitrile gloves | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Paper towels | VWR International LLC | BWK6212 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| PCR plate sealing film | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestles | VWR International LLC | 89038-166 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Plastic spatulas | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs – chloroplast and mitochondrial | PNA Bio | NA | Make sure to verify sequence bioinformatically |
| Protective eyewear | Millipore Sigma | Z759015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Rubber mallet (optional) | Ace Hardware | 2258622 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shears or scissors | VWR International LLC | 89259-936 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Shovel | Home Depot | 2597400 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Soil core collector (small diameter: <1 inch) | Ben Meadows | 221700 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Spray bottles | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry. |
| Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
| Weigh boats | Spectrum Chemicals | B6001W | Can substitute with equivalent from other suppliers. |
References
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