Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão
Summary
O protocolo descrito neste artigo usa o músculo levator auris longus (LAL) de rato para gravar espontânea e nervo-evocou potenciais pós-sinápticos (corrente-braçadeira) e correntes (tensão-braçadeira) na junção neuromuscular. Uso desta técnica pode fornecer insights-chave nos mecanismos de transmissão sináptica sob condições normais e doença.
Abstract
Este protocolo descreve uma técnica para gravar transmissão sináptica da junção neuromuscular sob condições de grampo-corrente e tensão-braçadeira. Uma preparação ex vivo do levantador auris longus (LAL) é usada porque é um fino músculo que proporciona fácil visualização da junção neuromuscular por empalamento microeléctrodo do motor placa terminal. Este método permite a gravação dos potenciais de placa terminal em miniatura espontânea e correntes (pptm e mEPCs), os potenciais de placa terminal evocado-nervo e correntes (EPPs e EPCs), bem como as propriedades de membrana da placa terminal motor. Resultados obtidos com este método incluem o conteúdo quantal (QC), número de sítios de liberação de vesículas (n), a probabilidade de liberação de vesículas (prel), facilitação sináptica e depressão, bem como a constante de tempo de membrana do músculo (τ m) e resistência de entrada. Aplicação desta técnica para modelos do rato da doença humana pode destacar as principais patologias nos Estados de doença e ajudar a identificar estratégias de tratamento de novela. Apertando totalmente tensão-uma única sinapse, este método fornece uma das análises mais detalhadas da transmissão sináptica atualmente disponível.
Introduction
Estudando a transmissão sináptica na junção neuromuscular fornece insights sobre a relação dinâmica entre os sistemas musculares, nervosos e esqueléticos e é um excelente modelo para analisar a fisiologia sináptica. O músculo levantador auris longus (LAL) é um músculo fino, permitindo às junções neuromusculares ser facilmente visualizado. Relatórios anteriores descreveram a conveniência de usar o leite para examinar as toxinas e drogas sinápticas e caracterizaram as características do tipo de fibra de músculo esquelético da LAL1,2. Numerosos estudos têm usado o LAL para examinar a fisiologia neuromuscular3,4,5,6,7,8. Para eletrofisiologia, a capacidade de observar facilmente as junções neuromusculares LAL permite a colocação exata de microeletrodos na placa terminal motor e reduz problemas de braçadeira espaço na gravação de transmissão sináptica. Corrente-braçadeira gravações das propriedades da membrana muscular, tais como a constante de tempo de membrana (τm) e resistência de entrada (Rem) são facilmente obtidas. Além disso, essas propriedades podem ser medidas de fibras musculares mesmas usadas para gravar a transmissão neuromuscular, permitindo uma comparação direta da função sináptica para as propriedades da membrana muscular. A análise destes dados pode fornecer insights-chave nos mecanismos físicos de muitas doenças neuromusculares e Estados de atividade alterada.
Um aspecto fundamental da técnica descrita aqui é a utilização de tensão-braçadeira para gravações sinápticas, que não estão sujeitos as não-linearidades encontradas na corrente-braçadeira e são independentes das propriedades da membrana muscular. Vantagens do uso de tensão-braçadeira em oposição à corrente-braçadeira para examinar a transmissão neuromuscular foram estabelecidas pelo pioneiro esforços na década de 19509. Sob corrente-braçadeira, EPPs que excederem 10-15 mV em amplitude não são um produto linear da amplitude pptm.9. Por exemplo, se o pptm média é 1 mV, uma EPP de 5 mV pode-se supor para ser o produto de 5 pptm (QC de 5); Considerando que, uma EPP de 40 mV será o produto de mais de 40 pptm. Essa não-linearidade no maiores EPPs ocorre porque a força motriz para o PPE, que é a diferença entre o potencial de membrana e o potencial de equilíbrio para o receptor de acetilcolina (~ -10 mV), diminui substancialmente durante grandes EPPs. Esse problema é evitado em experimentos de tensão-braçadeira não altera o potencial de membrana muscular durante experimentos de tensão-braçadeira. Uma desvantagem é que os experimentos de tensão-braçadeira são tecnicamente mais difícil do que a gravação de grampo-corrente. Com isto em mente, McLachlan e Martin desenvolveram uma correção de matemática simples que é responsável por não-linearidades em gravações de corrente-braçadeira de EPPs10. As correções funcionam bem11,12,13, mas importante, assumem que as propriedades da membrana muscular não foram interrompidas.
As propriedades da membrana muscular são especialmente importantes para considerar se a estudar as condições ou Estados de doença que perturbam o músculo. Por exemplo, o músculo esquelético do R6/2 modelo transgênico da doença de Huntington é hyperexcitable devido a uma redução progressiva no descanso de cloreto e potássio correntes14,15. Como consequência, pptm e EPPs são amplificados em músculo esquelético R6/2. Certamente, fatores adicionais podem alterar pptm e EPPs. Trabalhar com um modelo diferente de ratos a doença de Huntington (R6/1) encontrou alterações em EPPs que parecem estar relacionados com proteínas SNARE8. Para avaliar os mecanismos causando alterações de transmissão neuromuscular, seria benéfico eliminar os efeitos das propriedades de membrana muscular alterado usando uma tensão-braçadeira. Em um estudo recente, a transmissão neuromuscular R6/2 foi estudada em ambas as condições de corrente e tensão-braçadeira usando a técnica descrita neste documento. A totalidade das placas terminais motor foram tensão-fixada com menos do que 1% de erro, colocando dois microeletrodos dentro constante do comprimento da placa terminal16. Ele foi mostrado aquela tensão-braçadeira e corrigida registros de corrente-braçadeira rendidos medições contrastantes da transmissão neuromuscular no músculo R6/2. Isto ressalta que pode ser difícil corrigir EPPs não-linearidades se alteraram-se as propriedades da membrana muscular e mostra os benefícios de se obter registros de tensão-braçadeira independentes das propriedades da membrana muscular. O protocolo apresentado neste documento é ideal para examinar as condições ou Estados de doenças que afetam a transmissão sináptica e as propriedades da membrana pós-sináptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrito é a preparação e uso do mouse músculo LAL para a medição da transmissão neuromuscular sob condições de tensão ou corrente –braçadeira. Há vários pontos importantes a considerar para a dissecar o LAL. Limpar o excesso de tecido conjuntivo das aids de músculo em empalamento de eletrodo, como os eletrodos pode snag o tecido conjuntivo quando posicionando-os por empalamento. No entanto, só remover o tecido conjuntivo que pode ser retirado facilmente para limitar as chances de danificar o múscul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda Comentários editoriais, Ahmad Khedraki para ajudar a estabelecer essa técnica e Wright State University, para apoio financeiro (fundo de inicialização para A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
References
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