Summary

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

Beschrijven we een eenvoudig en gemakkelijk protocol voor het meten van antilichaam afhankelijk verbetering van infectie door Zika virus herstellende serum met Dengue virus verslaggever virale deeltjes.

Abstract

Antilichaam afhankelijk verhoging van de infectie is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in Dengue virale pathogenese. Traditionele tests die meten van de capaciteit van antilichamen of serum om infectie in ontoelaatbaar cellijnen hebben vertrouwd op met behulp van virale uitvoer in de media gevolgd door plaque testen te kwantificeren van de infectie. Meer recentelijk hebben deze gehaltebepalingen Dengue virus (DENV) infectie in de cellijnen met behulp van fluorescently gelabelde antilichamen onderzocht. Deze beide benaderingen hebben beperkingen die het wijdverspreide gebruik van deze technieken beperken. Hier beschrijven we een eenvoudige in vitro -assay met Dengue virus verslaggever virale deeltjes (RVP) die uitdrukking geven aan groen fluorescent proteïne en K562 cellen te onderzoeken van antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van DENV-infectie met behulp van serum dat werd verkregen van rhesus Makaken 16 weken na infectie met Zika-virus (ZIKV). Deze techniek is betrouwbaar, minimale manipulatie van cellen gaat, gaat niet over het gebruik van live replicatie bevoegde virus en kan worden uitgevoerd in een hoge doorvoersnelheid formaat om een kwantitatieve uitlezing met behulp van stroom cytometry. Bovendien, kan deze bepaling gemakkelijk aangepast worden onderzoeken antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van andere flavivirus infecties zoals gele koorts-virus (YFV), Japanse Equine encefalitis virus (JEEV), West-Nijlvirus (WNV) etc. waar RVP beschikbaar zijn. Het gemak van het opzetten van de bepaling, de gegevens analyseren en interpreteren van de resultaten maakt het zeer vatbaar is voor de meeste instellingen van het laboratorium.

Introduction

Antilichaam afhankelijk verhoging (ADE) van de infecties is een proces waarbij gedeeltelijk cross-reactive antilichaam reacties veroorzaakt door een serotype van het virus verbetert de opname van een ander serotype van het virus, wat leidt tot meer virale replicatie en voorjaarsviremie. ADE is uitgebreid gedocumenteerd in Dengue virus (DENV) infecties waar vier belangrijke serotypen heersen. ADE is een subset van patiënten, gekoppeld aan Dengue hemorragische koorts (DHF). We hebben onlangs aangetoond dat Zika virus (ZIKV) infectie veroorzaakt aanzienlijk hoge niveaus van DENV cross-reactive antilichaam reacties die veroorzaakt ADE van DENV in vitro en waarschijnlijk bijgedragen aan de verhoging van de DENV voorjaarsviremie in vivo1 , 2. antilichaam-afhankelijke versterking testen zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de capaciteit van antilichamen te versterken van secundaire infectie met verwante virussen en bieden waardevolle inzichten in de pathogenese van flavivirus infecties en informeren de ontwikkeling van vaccins.

De assay beschreven gebruikt hier DENV RVP samen met K562 cellen, die normaliter ontoelaatbaar om infectie zijn. RVP zijn structureel intact replicatie incompetent DENV virale deeltjes die coderen van een sub-genomic groen fluorescente proteïne (GFP) replicon die na een ronde van replicatie3wordt uitgedrukt. Als zodanig, cellen die geïnfecteerd raken met RVP lichten groen op en kunnen gemakkelijk worden opgespoord met behulp van stroom cytometry of microscopie. De RVP gebruikt in deze test werden verkregen uit commerciële bronnen. Ze kunnen echter tegen andere virussen gegenereerd en gebruikt in de test die wordt beschreven in dit manuscript. K562 cellen zijn ondertussen een FcγIII-receptor-uiting geven aan leukemie cellijn die binden aan de Fc-regio van antilichamen en in het bijzijn van de concentraties van antilichaam4,5sub te neutraliseren besmet raken.

ADE testen zijn uitgebreid gebruikt in studies die onderzoeken de risicofactoren voor ernstige dengue en af te bakenen de mechanismen van in vitro ADE6,7,8. De bepaling van de ADE beschreven hier snel en eenvoudig inzetbaar om te bepalen van de capaciteit van het serum te versterken in vitro infectie met behulp van de RVP en stroom cytometry, in vergelijking met andere testen momenteel gebruikt waarvoor hetzij de bepaling van de vorming van tandplak eenheden (FPU) in Vero-cellen of het antilichaam kleuring van geïnfecteerde cellen6,7,8,9,10,11, die beide tijdrovend en arbeid zijn intensieve.

Protocol

De serummonsters gebruikt om aan te tonen van het protocol die hier beschreven werden verkregen rhesus makaken die gehuisvest en verzorgd volgens lokale, staat en federale beleid in een vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care waren International (AAALAC)-geaccrediteerde faciliteit. Alle dierproeven zijn gecontroleerd en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité en monsters werden verworven door middel van een weefsel protocol voor het delen. <p class="jove_tit…

Representative Results

Sera van 4 rhesus makaken waren verzameld 16 weken na infectie met ZIKV en getest op hun potentieel om te verbeteren DENV-1, 2, 3 en 4 infecties in K562 cellen. De dieren had piek voorjaarsviremie van ~ 1 x 105 exemplaren ZIKV RNA/ml plasma door dag 3 na infectie die gedaald tot een niveau dat onder de limiet van detectie door 7 dagen na infectie. Geen voorjaarsviremie werd ontdekt in het plasma op 16 weken na infectie. Vervolgens de RVP assay werd uitgevoerd en de verzamelde g…

Discussion

Flavivirussen zoals DENV en ZIKV delen significante aanwijzingen dat de homologie in beide hun structurele en niet-structurele eiwitten die het genereren van antilichamen die met elkaar13,14 cross-react. Deze antwoorden cross-reactive antilichaam is aangetoond dat het verbeteren van besmetting zowel in vivo en in vitro met een heteroloog serotype of een andere gerelateerde flavivirussen1,2</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het beschreven project werd gesteund door fondsen van de Uniformed Services University van de gezondheidswetenschappen aan JJM. De adviezen of beweringen hierin zijn de privé van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of reflecterende de standpunten van het Department of Defense, de Uniformed Services University van de Health Sciences of enige andere instantie van de VS Regering.

WGV alle experimenten uitgevoerd en analyseren van de gegevens; JJM ontworpen en begeleid de studie; WGW en JJM schreef het papier.

Materials

DENV 1-4 RVP Integral Molecular RVP-501
K562 cells ATCC CCL-243
RPMI Corning 10-040-CV
FBS GE lifesceinces SH 30910.03 10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin MP biomedicals 1670049 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES Cellegro 25-060-Cl 0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145 1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate Cellegro 25-000-Cl 1mM in RPMI-10
L-glutamine Fisher Scientific MT25005CI 
Sterile V-bottom plates Thomas Scientific 333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes VWR 60819-728
Non-sterile U-bottom plates Falcon Ref 353910 A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette Denville P7127
200uL sterile pipette tips Denville P3020 CPS
20uL sterile pipette tips Denville P1121
50-200uL multichannel pipette Denville P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette Denville P3975-9-B
20% formadehyde Tousimis  #1008B
Water Bath ThermoFisher TSCOL35
thermomixer Eppendorf 2231000387 An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator ThermoFisher 13-998-213
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348
Flowjo 9.8 TreeStar, Inc. Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2 Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer Becton Dikinson
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348

References

  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

Play Video

Cite This Article
Valiant, W. G., Mattapallil, J. J. A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum. J. Vis. Exp. (134), e57371, doi:10.3791/57371 (2018).

View Video