Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika
Summary
Les auteurs décrivent un protocole simple et facile pour mesurer enhancement dépendante anticorps d’infection par virus de Zika sérum convalescent à l’aide de particules virales journaliste virus de la Dengue.
Abstract
Amélioration dépendante anticorps d’infection a été démontrée à jouer un rôle majeur dans la pathogénie virale de la Dengue. Traditionnels tests qui mesurent la capacité d’anticorps ou de sérum d’augmenter l’infection dans les lignées cellulaires inadmissible ont compté sur l’utilisation de production virale dans les médias, suivies par des essais de plaque pour quantifier l’infection. Plus récemment, ces tests ont examiné infection par le virus (DENV) la Dengue dans les lignées cellulaires à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés. Ces deux approches ont des limites qui restreignent l’utilisation généralisée de ces techniques. Nous décrivons ici un essai simple in vitro à l’aide de Dengue virus journaliste particules virales (VPR) qui expriment la protéine fluorescente verte et les cellules K562 à examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’infection DENV sérum obtenu à partir de rhésus macaques 16 semaines après l’infection par le virus Zika (ZIKV). Cette technique est fiable, implique la manipulation des cellules, ne nécessite pas l’utilisation de virus compétente de réplication direct et peut être effectuée dans un format haut débit pour obtenir une lecture quantitative à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce test peut être facilement adapté pour examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’autres infections flavivirus tels que les virus de la fièvre jaune (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (tarek), virus du Nil occidental (VNO) etc. où les VPR est disponibles. La facilité de mise en place du test, analyse des données et interprétation des résultats rendent très favorable à la plupart des paramètres de laboratoire.
Introduction
Amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l’infection est un processus par lequel partiellement une réaction croisée d’anticorps induits par un sérotype de virus augmente l’absorption d’un autre sérotype du virus, conduisant à une virémie et une augmentation de la réplication virale. ADE a été largement documenté dans les infections de virus (DENV) la Dengue où quatre principaux sérotypes sont fréquentes. Dans un sous-groupe de patients, l’ADE est associée à une fièvre hémorragique (DHF). Nous avons récemment démontré que Zika infection par le virus (ZIKV) induit des réponses en anticorps croisée DENV origine ADE de DENV in vitro et probablement contribué à l’amélioration de la virémie DENV in vivo1 significativement élevés , 2. dosages d’anticorps dépendant d’amélioration constituent un outil précieux pour évaluer la capacité des anticorps à améliorer une infection secondaire avec des virus apparentés et donnent des indications précieuses sur la pathogenèse des infections par un flavivirus et informer le développement de vaccins.
Le test décrit ici utilise DENV VPR ainsi que les cellules K562 qui sont normalement inadmissibles à l’infection. VPR est structurellement intact réplication incompétent DENV particules virales qui codent un réplicon sub-génomique protéine fluorescente verte (GFP) qui s’exprime après un seul tour de réplication3. Ainsi, les cellules qui deviennent infectées par VPR réagissant en vert et peuvent être facilement détectés à l’aide de la cytométrie en flux ou la microscopie. La VPR utilisé dans cet essai ont été obtenues de sources commerciales. Ils peuvent, toutefois, être produites contre les autres virus et utilisés dans le test décrit dans ce manuscrit. Pendant ce temps, les cellules K562 sont une lignée de cellules leucémie FcγIII-exprimant le récepteur qui se lient à la région Fc des anticorps et s’infectent en présence de neutraliser des concentrations d’anticorps4,5.
ADE dosages ont été largement utilisés dans les études portant sur les facteurs de risque pour la dengue sévère et pour délimiter les mécanismes de in vitro ADE6,7,8. Le dosage de l’ADE décrit ici peut être utilisé rapidement et facilement pour déterminer la capacité du sérum pour améliorer l’infection in vitro à l’aide de VPR et cytométrie en flux, par rapport à d’autres tests utilisés actuellement, qui nécessitent soit la détermination de la formation de plaque unités (pfu) dans les cellules Vero ou souillure d’anticorps infecté les cellules6,7,8,9,10,11, qui sont tous deux beaucoup de temps et du travail intensif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flavivirus comme DENV et ZIKV partagent des preuves significatives d’homologie dans les deux leurs protéines structurales et non structurales qui produisent des anticorps qui réagissent avec l’autre13,14. Ces réponses anticorps une réaction croisée ont été démontrés pour améliorer d’infection aussi bien in vivo et in vitro avec un sérotype hétérologue ou autres associés flavivirus1,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet décrit a été soutenu par des fonds de l’Uniformed Services University of the Health Sciences à JJM. Les opinions ou les affirmations contenues dans ce document sont celles des auteurs privés et ne sont pas pour être considéré comme officiels ou reflétant les vues du ministère de la défense, l’Uniformed Services University of the Health Sciences ou tout autre organisme des États-Unis Gouvernement.
WGV effectué toutes les expériences et analysé les données ; JJM conçu et supervisé l’étude ; WGW et JJM a écrit le livre.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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