قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة
Summary
يمكننا وصف بروتوكول سهلة وبسيطة لقياس تعزيز جسم تعتمد الإصابة بواسطة Zika المصل النقاهة فيروس حمى الضنك فيروس “مراسل الجسيمات الفيروسية” باستخدام.
Abstract
لقد ثبت تعزيز الإصابة يتوقف جسم تلعب دوراً كبيرا في نشوء المرض حمى الضنك الفيروسية. الاختبارات التقليدية التي تقيس قدرة الأجسام المضادة أو مصل لتعزيز الإصابة في خطوط الخلايا غير مسموح به يعتمد على استخدام إخراج الفيروسية في وسائط الإعلام تليها اللوحة فحوصات لتحديد حجم الإصابة. في الآونة الأخيرة، قد درست هذه فحوصات الإصابة بالفيروسات (DENV) حمى الضنك في خطوط الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي. وقد كلا النهجين هذه القيود التي تحد من استخدام هذه التقنيات على نطاق واسع. وهنا، يمكننا وصف مقايسة بسيطة في المختبر استخدام حمى الضنك فيروس مراسل الفيروسية جسيمات (رفبس) التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء والخلايا K562 لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) الإصابة DENV استخدام مصل الدم التي تم الحصول عليها من ريسوس ماكاكويس 16 أسبوعا بعد الإصابة بفيروس زيكا (زيكف). هذا الأسلوب هو موثوق بها وينطوي على الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا ولا تنطوي على استخدام النسخ المتماثل يعيش فيروس المختصة ويمكن أن يؤديها في شكل إنتاجية عالية للحصول على قراءات كمية استخدام التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) العدوى مصفر الأخرى مثل فيروس الحمى الصفراء (يفف)، فيروس “التهاب الدماغ الخيلي الياباني” (جيف)، فيروس غرب النيل (WNV) التي تتوفر فيها رفبس إلخ. سهولة إعداد التحليل، تحليل البيانات، وتفسير النتائج يجعل قابلية عالية لمعظم المختبرات إعدادات.
Introduction
جسم تعتمد تعزيز (ADE) العدوى هي عملية موجبة جسم جزئيا تحسن الاستجابات الناجمة عن النمط المصلي المسيطر فيروس يعزز الإقبال على النمط المصلي المسيطر آخر للفيروس، مما يؤدي إلى زيادة النسخ المتماثل الفيروسية وفريميا. تم توثيق ADE على نطاق واسع في حالات العدوى بالفيروس (DENV) حمى الضنك التي يكثر فيها اللقاح الرئيسية الأربعة. في مجموعة فرعية مرضى، يرتبط ADE بحمى الضنك النزفية (الدنك). ونحن قد أظهرت مؤخرا أن عدوى فيروس (زيكف) زيكا الناجمين عن مستويات مرتفعة إلى حد كبير من DENV جسم تحسن الاستجابات التي تسبب ADE DENV في المختبر والمرجح أن ساهمت في تعزيز DENV فيريميا في فيفو1 , 2-جسم تعزيز تعتمد فحوصات أداة قيمة لتقييم قدرة الأجسام المضادة تعزيز الثانوي عدوى الفيروسات ذات الصلة وتقدم أفكاراً قيمة في الآلية المرضية للالتهابات مصفر وتبلغ تطوير اللقاحات.
هنا يستخدم تحليل ووصف رفبس DENV جنبا إلى جنب مع خلايا K562 التي عادة غير مسموح به للإصابة. رفبس يتم النسخ المتماثل هيكلياً سليمة غير كفء DENV الفيروسية جزيئات ترميز ريبليكون بروتين sub-الجينوم فلورية خضراء (التجارة والنقل) التي يتم التعبير عنها بعد جولة واحدة من النسخ المتماثل3. على هذا النحو، الخلايا التي تصاب رفبس فلوريسسي الأخضر ويمكن الكشف سهولة استخدام التدفق الخلوي أو الفحص المجهري. رفبس المستخدمة في هذا التحليل تم الحصول عليها من مصادر تجارية. ومع ذلك، يمكن إنشاء مكافحة الفيروسات الأخرى والمستخدمة في التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة. ومن ناحية أخرى، هي خلايا K562 إلى التعبير عن مستقبلات FcγIII لوكيميا خلية خط ربط منطقة Fc من الأجسام المضادة، ويصاب حضور دون تحييد تركيزات من جسم4،5.
فحوصات ADE قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات التحقيق في عوامل الخطر للضنك الشديد وتحديد آليات في المختبر ADE6،،من78. والرزن ADE الموصوفة هنا بسرعة وسهولة استخدامها لتحديد قدرة المصل زيادة الإصابة في المختبر باستخدام رفبس والتدفق الخلوي، بالمقارنة مع فحوصات أخرى تستخدم حاليا، التي تتطلب أما البت في تشكيل اللوحة الوحدات (بفو) في الخلايا فيرو أو تلطيخ جسم من إصابة الخلايا6،،من78،9،10،11، كلاهما مضيعة للوقت والعمل مكثفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فلافيفيروسيس مثل DENV وزيكف حصة أدلة هامة على التماثل في كلا البروتينات الهيكلية وغير الهيكلية على توليد الأجسام المضادة التي كروسريكت13،14مع بعضها البعض. أظهرت هذه الردود جسم تحسن لتعزيز الإصابة في المختبر مع النمط المصلي المسيطر مغايرة أو أخرى سواء ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المشروع وصف الأموال من جامعة “العلوم الصحية” خدمات أونيفورميد لجيم. آراء أو التأكيدات الواردة في هذا التقرير هي تلك الخاصة المؤلفين ولا أن يكون تفسيرها كما الرسمية أو التي تعكس آراء وزارة الدفاع، وجامعة “العلوم الصحية” خدمات أونيفورميد أو أي وكالة أخرى تابعة للولايات المتحدة الحكومة.
وجف إجراء جميع التجارب، وتحليل البيانات؛ ججم صممت وأشرفت الدراسة؛ وكتب وجو وجيم الورق.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
