שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.
מנגנונים המערבות כל הגנום polyploidy תפקיד חשוב ב ההתפתחות והשינויים; כמו כן, דור חריג של תאים tetraploid נמצא קשור ההתקדמות של סרטן והן ההתפתחות של עמידות לתרופות. עד עכשיו, זה לא היה ריאלי לתמרן בקלות את פלואידיות של חיה multicellular ללא יצירת בעיקר סטרילי רומא. שהוצגו כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploid Caenorhabditis elegans חיות מכל כל זן דיפלואידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דעה קדומה באזור הבידוד כרומוזום במהלך המיוזה, בסופו של דבר הגדלת פלואידיות C. elegans. אסטרטגיה זו מסתמכת על ההפחתה ארעית של ביטוי של הגן rec-8 לייצר גמטות דיפלואידי. מוטציה rec-8 מייצר גמטות דיפלואידי פוטנציאלי שיוכל לייצר את tetraploids על הפריה. ערכת צייתן זו שימש ליצירת זנים tetraploid נושאת מוטציות, כרומוזום rearrangements כדי לזכות בתובנה dynamics כרומוזומלית ואינטראקציות במהלך השיוך synapsis של מיוזה. שיטה זו יעילה ליצירת זנים tetraploid יציב ללא סמנים גנטיים, ניתן להחיל על כל זן דיפלואידי, יכול לשמש כדי להפיק triploid C. elegans. שיטה פשוטה זו שימושית עבור חוקרים אחרים השאלות הביולוגיות היסוד הרלוונטיים יציבות הגנום, ג’ין המינון, קנה מידה ביולוגית, איתות חוץ-תאית, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות לתרופות, ו מנגנונים של היווצרות המינים.
Polyploidy כל הגנום קיימת ברחבי הטבע אשר לעתים קרובות צעד שנדרש לצורך הסתגלות היווצרות המינים, organogenesis, ריפוי פצעים, דרוג ביולוגי; זה ידוע גם לקדם סרטן והן עמידות בפני תרופות1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. תעשיות החקלאות, דוגה ליצור צמחים polyploid דגים, רכיכות על ידי טיפול כימי (למשל, קולכיצין ו- orzalin) כדי לקבל שיעורי צמיחה מהירה, מגושם היבול והמשק החי13, 14,15. ייצור ניסיוני ולא יעיל של tetraploids קיימת עבור דג זברה של עכבר דגם מערכות16,17. עם זאת, רוב או כל polyploid multicellular שנוצרו על ידי בעלי החיים embryonically קטלני או סטרילי, ולכן לא אידיאלי במחקרי מעבדה על ההשפעות של polyploidy האורגניזם multicellular. כתוצאה מכך, כל הבנה של כל הגנום polyploidization אורגניזמים רב תאיים הוגבלה מינים קרובים אבולוציונית האחרונות polyploidization אירועים18,19,20 . נתיב כדי לקדם שאילתות של תפקיד ביולוגי או ההשלכות של polyploidization הוא השימוש של מערכת דגם C. elegans . חשוב, C. elegans הוא מערכת גנטית צייתן בדרך כלל קיים דיפלואידי, מכילה רק 5 autosomes (א) וכרומוזום מין אחד (X) לכל הגנום, הוא שקוף ומאפשר ויוו השגחה של תהליכים ביולוגיים, ו יש מחזור חיים קצר של 3-4 ימים (מביצה לבוגר בגרו). C. elegans הוכח להיות מסוגל לשחזר כמו tetraploid, אשר הוא הסוג הנפוץ ביותר של כל הגנום polyploidy בטבע. Triploid בעלי חיים יכול להיווצר על ידי חציית tetraploids עם diploids, אבל פלואידיות שלהם אינו יציב, ולהיות הזנים דיפלואידי בתוך כמה דורות.
ב העשורים האחרונים רק קומץ של קיימא הפורה של C. elegans זנים tetraploids היו מבודדים במעבדה, באמצעות אסטרטגיה מפרך, יוצר רק מוגבל סוגי זנים21,22, 23. אסטרטגיה זו יוצר tetraploids C. elegans באמצעות טיפולי הלם חום, אשר ככל הנראה משפיע על כרומוזום ההפרדה גמטות, הקרנה לבעלי polyploid בשם באמצעות סמנים גנטיים. Tetraploids האלו היו מאוד שימושי בירור של איך זה תולעים נימיות קובע אם להיות זכר או אנדרוגינוס. לימודי מאוחר יותר להשתמש זנים זמין כדי לחקור את הצמיחה, מנה ג’ין, ורגולציה של synapsis במהלך המיוזה הזה24,25,של נמטודות21,26. למרבה הצער, מחקרים אלה היו מוגבל על ידי הקושי ביצירת זנים חדשים tetraploid, על רקע גנטיים זנים אלו הכילו. המוצג כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploids יציב, אשר שימש ליצירת זנים ללמוד ויסות synapsis במהלך המיוזה27.
כמו בטבע, polyploidization יכול להיווצר על ידי היווצרות של דיפלואידי במקום גמטות הפלואידי. מציאת שלנו כי מוטציה רכיב rec-8 מיוזה ספציפי cohesin מייצר זרע דיפלואידי, oocytes עולה כי הורסים את הגן rec-8 יגרום בייצור של רומא tetraploid (איור 1)27, 28,29. יצירת זנים tetraploid פשוט כרוך הורסים rec-8 על ידי התערבות RNA (RNAi), במשך שני דורות על מנת phenocopy התכונה rec-8 גמטות דיפלואידי מוטציה. בשם polyploids ניתן לזהות בקלות על ידי שלהם יותר מאשר גודל גוף נורמלי. Polyploids מאושרות כמו tetraploids מלאה או חלקית על-ידי ספירת מספר כרומוזומים לכל גרעין יציב קווים הם הוקמה לאחר.
האסטרטגיה המתוארים כאן מאפשר את הדור של יציבה tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשונית הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים. מאחר פרוטוקול זה יותר יעיל, תכליתי, ופשוט יותר ערכת בעבר, הוא יתרחב את הכלים הדרושים כדי לבצע שאילתה על התפקידים של polyploidization בתהליכי יסוד של פיתוח, יציבות הגנום באבולוציה multicellular אורגניזמים. המגבלה רק הנראה לעין בשימוש של פרוטוקול זה הוא עמיד בפני RNAi גנטי ברקעים.
בייצור גמטות הפלואידי (n) הוא המפתח ליצירת זיגוטה דיפלואידי (2n)-הפריה. הפחתה זו של הגנום מתבצע במהלך המיוזה עם שתי חלוקות תאים עוקבים אחרי שכפול גנום יחיד. כדי ליצור הפלואידי גמטות, C. elegans, כמו עם רוב metazoans אחרים, הפרדת maternally, בטון אבהי-נגזר homologs בליגה הראשונה, ואילו האחות chromatids של כל homolog ולברים בליגה השנייה. אחת דרך את הגנום כולו polyploidy מתעוררת בטבע היא דרך הדור של גמטות להיכשל חצי גודל הגנום שלהם במהלך המיוזה.
זה ידוע כבר מעל 50 שנה את tetraploid C. elegans נמטודות הן קיימא ופורה. Nigon23, ו מאוחר יותר תלול בטירוף ו, הרמן22, שנוצר וזיהה קומץ של tetraploids C. elegans באמצעות שיבוש סגרגציה כרומוזום meiotic באמצעות טיפולי חום-הלם ושימוש גנטיים, בהתאמה. סינגל נוסף briggsae ג tetraploid זן נגזר באמצעות פרוטוקול זה למעלה מ-30 שנה מאוחר יותר24. Tetraploids אלה נוצלו לחקור איך C. elegans לקבוע אם להיות זכר או אנדרוגינוס, איך פלואידיות מווסת את קצב גדילתם וגודלם, וכדי לנתח זיווג ואת synapsis של מיוזה25,26, 38 , 39 , 40. אך אלה ומחקרים נוספים הדורשים שימוש tetraploids ספציפי או זנים triploid היו מוגבל על-ידי הקושי ביצירת זנים tetraploid בשיטה זו.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של 4A מלאים יציב, 4 X ושל חלקי 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשוני הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים.
Tetraploidy עלולה להיווצר על ידי יותר מאשר מנגנון אחד C. elegans:
תלול בטירוף ו, הרמן הציע כי זנים tetraploid שהם יצרו כנראה נגזר מצב ביניים triploid. זנים שלהם התקבלו באמצעות בחירה דורות מרובים או על ידי חציית את triploid בשם ביניים עם זכרים דיפלואידי22. הליקויים בעבודת כרומוזום למחיצות בתוך לחלילית-8 מוטציות כי נותן לעלות oocytes דיפלואידי, זרע להציע מנגנון אפשרי אחר, שבו חיות tetraploid שעלולות להתעורר עם rec-8 RNAi ערכת27.
אנדרוגינוסים RNAi שטופלו rec-8 יכול לייצר דיפלואידי oocytes ו spermatocytes, אשר להצמיח בעלי חיים tetraploid על הפריה. בקנה אחד עם האפשרות הזו היא העובדה כי חלק אנדרוגינוסים F2 משובטים הולידה זנים לון יציב בהדור הבא, אשר עולה כי את אנדרוגינוסים לון F2 משובטים שם כבר tetraploid. לפי שיטת החצייה, הדור הראשון של אנדרוגינוסים RNAi מטופלים rec-8 הוא חצה עם זכרים ללא טיפול. Spermatocytes דיפלואידי יכול להיווצר עדיין אצל גברים כי הצלב נעשה בנוכחות חיידקים לבטא dsRNA rec-8 , לכן, גברים נחשפים rec-8 RNAi במהלך ההזדווגות לפחות 3 ימים. לכן, polyploids לון בערכת cross-fertilizing יכול גם יצרו מן ההפריה של oocytes דיפלואידי על ידי הזרע דיפלואידי. זני tetraploid יציב שעלולים להתעורר גם הפריה בין גמטות דיפלואידי או במעבר triploid חיות המכיל oocytes של פלואידיות משתנה עם חיות דיפלואידי בייצור הזרע הפלואידי.
שיקולים חשובים:
העצמי-לעומת ערכות הפרייה:
ערכת להפרות עצמית rec-8 RNAi F1 אנדרוגינוסים ובא ערכת המערבים מעבר של אנדרוגינוסים שטופלו עם לא מטופל בשני זכרים הולידה 4A, 4 X ו- 4A, זנים tetraploid X 3. למרות polyploids עוד היו בתחילה שבודד הערכה עצמית המפרה, יותר של בעלי חיים polyploid אלה היו סטרילי, ובכך הן ערכות יעילים באופן דומה לייצר זנים יציב tetraploid. הסיבות להצלחת מוגברת ו עקרות בערכת עצמית המפרה נותר עלום. למרות שתי ערכות יעילים באופן דומה, הערכה עצמית המפרה היא קלה יותר כאשר היא אינה דורשת את הבידוד של הזכרים להזדווגות. בנוסף, כאשר המתח עניין לא יעיל או פגומה-הזדווגות, הערכה עצמית המפרה. עדיף שלא ערכת cross-fertilizing עשוי לשמש ליצירת tetraploids מורכבים המכילים יותר מ שתי גרסאות של כרומוזום יחיד.
שינויים ומגבלותיה:
כיום, פרוטוקול זה כרוך rec-8 RNAi טיפול על ידי האכלת חיידקים לבטא dsRNA עבור הגן rec-8 . לפיכך, פרוטוקול זה לא עובד במינים Caenorhabditis להגיב RNAi מאכילים, או מוטציות פגומים ההתפשטות סביבתי או מערכתית של RNAi בין רקמות-41,–42,–43. פוטנציאל ניתן לפתור בעיה זו על ידי החדרת RNAi טיפול על ידי הזרקה ישירה של dsRNA עניין ישירות לתוך germline.
חיות triploid להפיקם באמצעות מעבר של tetraploid חיה דיפלואידי שממנו הופק, כי ערכה זו אינו יוצר יציב זנים triploid44,45. רק 15% מכלל הביצים הוליד triploids הפתח, הצאצאים שלהם בעיקר סטרילי רומא עקב אנאפלואידיה. בנוסף, הוא צאצא פורה ששרדו כמה נוטים להיות מלא או בסמוך diploids בתוך כמה דורות. זה סביר, לפחות בחלקו, כי oocytes חלקית מתקן טריזומיה מאת פנקסי כרומוזום השלישית לגוף קוטב meiotic במחלקה הראשונה.
מגבלה בלתי עבירים של פרוטוקול זה היא כי זה לא עובד עבור ביצוע tetraploids של מוטציות המשפיעות על רכיבים של מכונות RNAi כי הם עמידים בפני טיפול RNAi46.
פתרון בעיות:
RNAi rec-8:
כמה שיקולים מכריעים עבור פרוטוקול זה מוצלח. הראשונה היא להשתמש IPTG טריים וצלחות IPTG NMG טרי עבור אינדוקציה של ייצור dsRNA rec-8 חיידקים חיידקים HT115 נושא השיבוט rec-8 (W02A2.6). IPTG הוא רגיש אור וזה חשוב לצמצם חשיפה קלה צלחות. ניתן לאחסן IPTG צלחות עד חודש ב 4 ° C בחושך. שנית, rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 זני חיידקים מן הספריה Ahringer (Kamath ו- Ahringer 2003) הניב הפנוטיפ rec-8 חזקה יותר מאשר אחרים זמינים rec-8 HT115 שיבוטים.
זן tetraploid תחזוקה:
זני tetraploid גדלים באיטיות ומפיקים לכל היותר 50 progenies לכל דור47. כל זני tetraploid מזוהה יציבים יחסית, אך הם יכולים לשבור ולהפוך כאשר דיפלואידי הדגיש (תקשורת אישית ג’ונתן הודג’קין ותצפיות שלנו שלא פורסמו). לכן, חשוב לציין כי כאשר זנים tetraploid גדלים 25 ° c, חום-בהלם, מורעבים, או קפוא, מופשר, הם יכולים במהירות לחזור diploidy, לכן חשוב להמשיך לאסוף את החיות לון כאשר מפשירה זנים אלו או כאשר חשיפת זנים אלו בתנאים מלחיצים שעלולות לגרום להם לחזור.
יישומים אפשריים:
חקירה של האפקט או את התפקיד של כל הגנום polyploidization האבולוציה, מחזור התא, ביטוי גנים ופיתוח אורגניזמים רב תאיים הסתמכה על השוואות בין: תאים באורגניזם המכילים פלואידיות שונים, באותו התא סוגי קשר הדוק מינים עם פלואידיות שונים, או מינים אשר עברו האירועים polyploidization האחרונים אבולוציונית, בידוד פיזי3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. למרות tetraploids יכול להיגזר דג זברה ומערכות מודל של העכבר, הצאצאים שלהם הם סטרילי או קטלני embryonically16,17. בנוסף, המערכות הללו דגם יש מחזורי החיים הארוכים, בהשוואה ל- C. elegans, ואת השיטות הזמינות כדי ליצור חיות polyploid הן מורכבות ולא יעיל. לכן, זנים של C. elegans נגזר על ידי שיטה זו תהיה אינסטרומנטלי לקדם כל חקירה על תופעות ועל תפקידיה של כל הגנום polyploidy אורגניזמים רב תאיים.
מאז triploid הנגזרות של tetraploid על ידי חוצה את tetraploid המקורי דיפלואידי, השוואה בין diploids, triploids tetraploids זה רק נבדלים מספר העותקים הגנום, מספק הזדמנות ייחודי וחסר תקדים הערכת שווי ערך חיות/איברים/תאים עם גודל הגנום שונים (או מנה ג’ין). גמישות ונוחות ערכת המתוארים כאן אפשרה לנו ליצור עשרות זנים tetraploid מרקע גנטי דיפלואידי או karyotypes. כמה זנים אלה שימשו כבר למנגנונים שאילתה של כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis במהלך המיוזה27.
זני tetraploid פראי סוג של מוטציה נושא סמנים פלורסנט תספק דרכים חדשות חקירה כדי להבין את קשרי הגומלין בין יחס הגודל של גרעיני/ציטוזול הגנום על החיה תאיים/סלולרי/עוגב ו כל שינוי קנה מידה, הגנום כולו polyploidization על הסתגלות, היווצרות המינים, מנה ג’ין, ביטוי ופיתוח רקמות ו עוגב. בנוסף המחקר של שינוי קנה מידה ביולוגית, הדור של זנים tetraploid יהיה משמעותי נוסף שאילתות של שאלות עקרוניות ביולוגיים הרלוונטיים יציבות הגנום איתות, חוץ-תאית, endoreduplication, הגנום כולו שכפול, ג’ין המינון, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות סמים, ואת מנגנון היווצרות המינים…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למרכז גנטיקה Caenorhabditis (במימון המכון הלאומי לבריאות (NIH) במשרד של מחקר תשתית תוכניות P40 OD010440) עבור זנים. המחברים רוצה להודות בטיסט Roelens, אלי Lessman, סיפק לנו משוב בונה, המעבדה מנו ב CCNY, הנטר לשימוש של המעבדה שלהם עבור חלק הצילומים ועבור סיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס PSC-הנטר TRADB-46-113 ולהעניק NIH 1SC2GM118275-01. טרשת נפוצה מומן בחלקו על ידי מוסד קנדי מלגת פוסט-דוקטורט בריאות (CIHR), E.K. נתמכה על ידי עלייה NIH/NIGMS הענק GM062981.
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |