Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos
Summary
Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.
Abstract
Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.
Introduction
El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera línea de defensa. Los macrófagos alveolares (AMs) son un tipo de fagocitos reside en el pulmón, y constituyen la inmensa mayoría de la piscina de macrófagos del pulmón. Como su nombre lo indica, AMs se localizan sobre todo a la luz alveolar y se presentan como células sésiles que constantemente muestra la atmósfera ambiente y comunican con el epitelio alveolar1. En estado estacionario los pulmones, más del 95% de los fagocitos en el espacio alveolar son AMs2, cuya composición puede alterar debido a inflamación, infección o exposición crónica a contaminantes.
AMs participan en una amplia gama de funciones que pueden ser locales a los pulmones o de importancia sistémica. Por ejemplo, AMs son esencial en el desarrollo y el óptimo funcionamiento de los pulmones; vigilancia inmune; y la separación de los desechos celulares, invasión de patógenos y partículas inhalado3,4,5,6,7. Agotamiento objetivo del AMs es conocido por afectar la separación de virus respiratorios y bacterias4,8. Además de su papel como los fagocitos y los defensores de una primera línea de la homeostasis pulmonar, AMs se conocen para funcionar como células presentadoras de antígeno en obtención de T de la célula de inmunidad9, potenciando la eficacia de la vacuna intranasal10 y influir en la restricción pulmonar autoinmunidad después de trasplante de pulmón11,12. Deficiencia en la función de AM se ha relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP), una condición que resulta de una mutación genética, malignidad o infección que impide la separación de surfactantes pulmonares13,14. Trasplante de AMs ahora se está estudiando como un enfoque terapéutico para el tratamiento del PAP 15,16.
AMs se sabe que se originan durante la embriogénesis y a persistir en los pulmones durante toda la vida sin sustituidos por circular leucocitos2,17. Aunque, AM es indetectable en los pulmones homeostáticos, diferentes niveles de volumen de AM se han divulgado en ciertas condiciones clínicas, incluyendo infección por el influenza virus4, myeloablative irradiación18, exposición a endotoxinas 19y20de la tercera edad. AMs se cree que uno mismo-renovar vía una baja proliferación17,21, pero algunos estudios recientes afirman que los monocitos pueden dar lugar a una población de22,de macrófagos intravasculares pulmonares23 bajo condiciones experimentales, pero la funcionalidad de estos macrófagos pulmonares recién convertidos todavía tienen que definirse en enfermedades pulmonares. Por otra parte, entender el umbral de estímulo en el contexto de activación de AM es un área potencialmente interesante, como el pulmón trata de conservar un equilibrio entre las señales inflamatorias y los mecanismos inmunoreguladores.
Las alteraciones fisiológicas o patológicas que conducen a la pérdida de regulación inmune están importantes para evaluar en diversos contextos clínicos (p. ej., infecciones respiratorias, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedad pulmonar fibrótica). Sin embargo, AMs son cada vez más reconocido como indicadores o incluso determinantes de la salud pulmonar11,24. Actualmente, no están disponibles para la recolección, caracterización y mantenimiento AMs de seres humanos y modelos preclínicos murinos protocolos unificados. Falta de un consenso sobre precursores de AM y fenotipos y la ausencia de una metodología detallada han sido la gran barricada en descifrar funciones de AM en la enfermedad y la salud pulmonar. El siguiente protocolo ofrece una identificación definitiva, aislamiento y en vitro cultura estrategia que mucho avanzar en la comprensión del comportamiento de AM y facilitar estudios diagnóstico y terapéuticos orientada a AM.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera26. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de7 y12 y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar24 han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones11,27 y participan en la activación …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Clare Prendergast ayuda con editar el manuscrito. DKN es apoyada por una investigación conceder (#2095) de la Fundación Flinn y TM es apoyado por becas de institutos nacionales de salud (R01HL056643 y R01HL092514). DKN desarrolló los métodos, diseñó el estudio y escribió el manuscrito; OM con los estudios en animales y obtención de la muestra clínica; SB asistida con análisis cytometric del flujo y separación celular; TM bajo la supervisión de los estudios y revisaron el manuscrito.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
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