כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.
טכניקה שימושית עבור culturing תאים עצמית וההספק nanofiber תלת מימד (3D) לפיגום מתואר. מערכת זו תרבות משחזר סביבה מקרוב מחקה את התכונות מבנית של הרקמה הלא מקוטב. יתר על כן, מבנה מסוים nanofiber מהותי לגרדום הופך שקוף לאור ויזואלי, המאפשר ויזואליזציה קל של הדגימה תחת מיקרוסקופ. יתרון זה שימש בעיקר ללמוד נדידת תאים, הארגון, התפשטות, ואת בידול ולכן כל התפתחות תפקוד התאים מסוים שלהם על ידי צביעת עם צבע מסוים או הגששים. יתר על כן, בעבודה זו, אנו מתארים את ביצועים טובים של מערכת זו ללמוד בקלות את redifferentiation של chondrocytes במפרק האנושי המורחב לתוך רקמות הסחוס. התאים היו מקופל לתוך עצמי בהרכבת פיגומים פפטיד, תרבותי בתנאים מסוימים כדי לקדם את chondrogenesis. תרבויות תלת מימדי הראו הכדאיות טוב במהלך 4 השבועות של הניסוי. כצפוי, דגימות תרבותי עם inducers chondrogenic (לעומת פקדים שאינם-induced) צבעונית מאוד חיובית טולדין כחול (אשר כתמים glycosaminoglycans (GAGs) כי הם מאוד נוכח מטריצה חוץ-תאית סחוס) והביע סמנים מולקולריים ספציפיים, לרבות קולגן סוג אני, II ו- X, על פי ניתוח המערבי כתם. פרוטוקול זה קל לבצע והוא יכול לשמש במעבדות מחקר, תעשיות, למטרות חינוכיות בקורסים מעבדה.
במשך עשורים רבים, תרבית תאים בתרבית של בוצעה בתנאים ניסיוני באמצעות מערכות התרבות הקלאסית דו-ממדית (2D) עקב בעיות מעשיות וכלכליים בין ההיבטים הלא-פיזיולוגיים. למרות מערכת תרבות זו מסייעת ללמוד ולהבין מנגנונים מולקולריים וסלולריות ביותר, אנו יודעים היום פרדיגמות חדשות של התרבות תאים נדרשים ללמוד מערכות סלולריות מורכבים יותר. לכן, מערכות תלת מימד (3D) התרבות הן במקרה הצורך, כדי לשחזר את microenvironment biophysically, biomechanically וביולוגית דומה יותר לזה של רקמות טבעי. בשנים האחרונות, מערכות התרבות תלת-ממד, באופן כללי, הפכו להיות נפוץ יותר בקרב חוקרים והתעשייה מאז שהם מייצגים, מודל חדש של מחקר או הקרנה אילו תאים יכולים לגדול בחלל, ליצור לתא או תא-כדי-מטריקס אינטראקציות, העברה, בסופו של דבר להבדיל לתוך שושלות תאים מסוים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשחזר במבחנה הסלולר microenvironment כי הוא קרוב יותר microenvironment ויוו . בפרט, לגרדום פפטיד עצמית וההספק סינתטי (לטמבלים) הוא סוג של biomaterial עם מאפיינים ייחודיים; היא יוצרת רשת של נקבוביות בגודל ננומטר עשוי חלש אינטראקציות בין פפטידים בעלי תכונות מכניות ומבניים דומים לאלה של מטריצה חוץ-תאית טבעיים. במילים אחרות, הרציונליות מאחורי השימוש בחומר זה הוא שיוצר באמת 3D-סביבה זה הינו אידיאלי עבור קבלת מדומה 3D הרקמות או האיברים יחידות. עם זאת, והכי חשוב, ההקשר 3D מאפשר את מבנה תלת-ממד להשיג תפקודים ביולוגיים חדשים שאינם בדרך כלל נוכח התרבות 2D פלטפורמות, כגון מאפיינים הקשורים רקמות אדריכלות, תופעות העברה המונית, תא המתבנת ובסופו של דבר מורפוגנזה רקמות, אשר הם גורמי מפתח להמשך המחקר ופיתוח של רקמות פונקציונלי ואת האיברים1,2. יתר על כן, היתרון לטמבלים מעל עמיתיהם טבעי (קולגן, Matrigel) הוא שהם יציבים מאד בטמפרטורת החדר ו אינם דורשים תנאים מיוחדים עבור פוסט-פרודקשן, הפצה או אחסון3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. לטמבלים קל לטפל, בעת הצורך; ג’לים 3D ניתן להשיג בפשטות על ידי הגדלת כוח יונית, או על-ידי התאמת רמת ה-pH נייטרליות1,2. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת כאן כבר בשימוש נרחב במבחנה לקידום וצמיחה, תחזוקה, של בידול של מספר סוגי תאים, כולל chondrocytes, hepatocytes, תאי אנדותל, תאי העצם, כמו גם תאים עצביים תאי גזע עובריים וגופניות3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים את השימוש של מערכת תלת-ממד-תרבות להבדיל בין האדם chondrocytes במפרק המורחב (הע ח) לתוך רקמות הסחוס דמוי כפי שתואר לעיל11.
כאן, מתוארת שיטה התרבות תאים במערכת תלת-ממד באמצעות אידיוטים. ב הזה biomaterial סינתטי, התאים מעורבבים קודם עם פתרון פפטיד, אשר כתוצאה מכך מושרה להרכיב עצמית, יצירת רשת של מידות nanometric מסביב לתאים, ולכן יצירת סביבת 3D באמת (איור 1). חשוב לקחת בחשבון כי התנהגות הסלולר מושפע ערכים נוקשות מטריקס (קרי, הפצה, העברה ובידול). לכן, פקד מתודולוגי נפוצה היא התרבות תאים מעל לגרדום פפטיד עם אותם ערכי נוקשות (תרבות על שני ממדים).
בעבר, הקבוצה שלנו ואחרים תיארו את השימוש פלטפורמות תרבות תלת מימדי (3D) עם תא מגוון מערכות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה קלה ומהימנה של קבלת התרבות 3D תאי גזע מערכות המתאימים לכל סוג של תאים בתרבית של כולל לכל סוג של תא פונקציונלי, עובריים או למבוגרים, או בסופו של דבר, תאים מתפקדות מבודד ביופסיות או גידולים, וכן הלאה. בנוסף, באופן עצמאי, אם בתאי גזע עובריים או מבוגר המקור יהיה להם קיבולת מחויבות שושלת היוחסין טוב יותר בסביבת 3D מאשר התרבות הקלאסית 2D מנות10,11,12, 13,14,15. לכן, התרבות תאים במערכת זו תוביל בידול לתוך מבנים דמויי רקמה תפקודית שיכול לשמש ביישומים שונים, מן וההתערבות תיקוני או משובי כדי רעילות פלטפורמות תרופתי.
הראו לנו רווח ברור בתפקוד התא. כי microenvironment תאית דומה לזה של רקמות טבעי מבחינת מבנה מטריצה של ביו-מכני, biophysical, ביולוגי פרמטרי. יחד עם זאת, המערכת הופך מורכב יותר, מספר הפרמטרים שצריכים להיות מוסדרים גם עליות, אשר כוללת את הצורך פלטפורמה התומכת חיצוניים (כגון מערכת זלוף פעיל כדי למנוע בעיות תופעות הקשורות בהעברת המוני ). תאים בתרבית three-dimensionally לבצע טוב יותר מבחינת וויסות פעולות חיוניות, כגון העברה, התפשטות, בידול. הם יכולים יוצרים רשתות מורכבות ומאפשר crosstalk הסלולר משופרת, וזה עד כה חיוניים תולדה של וגדל המבדילים ב- 3D. העובדה כי הורס יכול ליצור תנאים במבחנה דומה מייצג חלבונים אלה מטריצה חוץ-תאית יתרון שכן מחקר רציונלי של האפקט הפיק עבור כל רכיב המתווסף לגרדום (פקטורי גדילה, רב-סוכר או איתות פפטיד) יכולים להיות מועברים בקלות.
היתרונות ברורים של השימוש של אידיוטים בהשוואה פיגומים טבעיים אחרים, כגון קולגן מסוג I ו- Matrigel, הם הבאים: 1) לטמבלים הוא biomaterial סינתטי עם וריאציה מינימלי של אצוות ייצור אצווה; 2) לטמבלים יש את היכולת להיות functionalized עם מוטיבים פפטיד ספציפי; ו 3) מתנות לטמבלים נמוך biodegradability במבחנה, דבר המאפשר שמירה על הבונה 3D עם אותם מאפיינים biophysical, ביו-מכני, מבניים לאורך זמן. עם זאת, המגבלה של שימוש הורס לעומת אחרים פיגומים נמצאו במהלך השלב כימוס, שבו התאים נמצאים סביבה עוינת בשל ה-pH נמוך. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. יתר על כן, חשוב לקבוע ריכוז לטמבלים עבור כל סוג תאים מסוים לפני התחלת כל ניסוי. זה חיוני, למעשה, כאשר תאים מתורבתים או לתוך אלה biomaterials, מאז כל סוג לתא מסוים יציגו תנאי הגידול biomechanical אופטימלית.
לבסוף, אנו מאמינים פבריקציה נוספת לסוג זה של biomaterial לגרדום ועיצוב לשפר את פיתוח מודלים 3D רקמות פיזיולוגיים ואמין יותר כדי לעזור תעשיית התרופות לפתח גישות טיפוליות טוב יותר עבור רפואה רגנרטיבית, סרטן או כל טיפול רפואי.
The authors have nothing to disclose.
למחקר שמתבצע על ידי המחברים נתמך בחלקה על ידי מענקים מן האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 229239 ומן קרן אאו, גישוש מחקר שיתופי מחקר תוכנית חריפה הסחוס פציעה/הנגע/פגם (ה-CRP ACI) תחת הפרויקט Bioactive, פיגומים ביונים עבור התחדשות הסחוס (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |