Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.
Een handige techniek voor het kweken van cellen in een zelfassemblerende nanofiber driedimensionale (3D) steiger wordt beschreven. Dit systeem van cultuur herschept een omgeving die nauw samen van de Nabootsers van de structurele kenmerken van niet-gepolariseerd weefsel. Anderzijds maakt de specifieke intrinsieke nanofiber structuur van de steiger het transparant om visueel licht, die het mogelijk voor eenvoudige visualisatie van het monster onder microscopie maakt. Dit voordeel werd grotendeels gebruikt voor het bestuderen van cel migratie, organisatie, proliferatie, en differentiatie en dus elke ontwikkeling van hun bijzondere cellulaire functie door kleuring met specifieke kleurstoffen of sondes. Bovendien, in dit werk beschrijven we de goede prestaties van dit systeem gemakkelijk de redifferentiation van uitgebreide menselijke articulaire chondrocyten studeren in kraakbeenachtige weefsel. Cellen werden ingekapseld in het zelf monteren van steigers van peptide en gekweekt onder bepaalde voorwaarden ter bevordering van chondrogenesis. Driedimensionale culturen toonde goede levensvatbaarheid in de 4 weken van het experiment. Zoals verwacht, monsters met chondrogenic-inductoren (vergeleken met niet-geïnduceerde besturingselementen) gekweekte gekleurd sterk positief voor toluïdine blue (die vlekken glycosaminoglycanen (GAGs), die zeer aanwezig in de extracellulaire matrix kraakbeen zijn) en uitgedrukt specifieke moleculaire markers, met inbegrip van collageen type I, II en X, volgens de analyse van de Western Blot. Dit protocol is gemakkelijk te voeren en kan worden gebruikt op onderzoekslaboratoria, industrieën en voor educatieve doeleinden in laboratorium cursussen.
Voor vele decennia lang werd zoogdiercellen cultuur uitgevoerd onder proefomstandigheden met behulp van klassieke tweedimensionale (2D) cultuur systemen als gevolg van praktische en economische kwesties ongeacht de niet-fysiologische aspecten. Hoewel dit cultuur-systeem helpt te bestuderen en begrijpen van meest moleculaire en cellulaire mechanismen, weten we vandaag dat nieuwe cel cultuur paradigma’s te bestuderen van meer complexe cellulaire systemen nodig zijn. Daarom zijn driedimensionale (3D) cultuur systemen nodig om opnieuw een communicatie thats biofysisch, biomechanisch en biologisch meer vergelijkbaar met dat van natuurlijke weefsels. In de afgelopen jaren 3D cultuur systemen, in het algemeen, zijn uitgegroeid tot vaker tussen onderzoekers en industrie omdat zij een nieuw model van studie vertegenwoordigen of screening in welke cellen kunnen groeien in de ruimte, maken van cel naar cel of cel-naar-matrix interacties, migreren en uiteindelijk onderscheiden in specifieke cel geslachten.
Het algemene doel van deze methodiek is om opnieuw een in vitro cellulaire communicatie dat dichter bij de communicatie in vivo . In het bijzonder is de synthetische zelfassemblerende peptide steiger (SAPS) een soort biomaterial met unieke eigenschappen; het vormt een netwerk van nanometer-sized poriën gemaakt van zwakke interacties tussen peptiden met mechanische en structurele eigenschappen vergelijkbaar die van natuurlijke extracellulaire matrices. Met andere woorden, de rationaliteit achter het gebruik van dit materiaal is dat het creëert een echt 3D-omgeving die is ideaal voor het verkrijgen van pseudo-3D weefsels of orgelunits. Maar bovenal de 3D context kan de 3D-structuur te krijgen nieuwe biologische functies die normaal niet aanwezig in 2D cultuur platformen, zoals eigenschappen die betrekking hebben tot weefsel architectuur, massaoverdracht verschijnselen, cel patronen en uiteindelijk weefsel morfogenese, die zijn de belangrijkste factoren in toekomstig onderzoek en ontwikkeling van functionele weefsels en organen1,2. Bovendien, een voordeel van sappen over hun natuurlijke tegenhangers (collageen, Matrigel) is dat ze zeer stabiel bij kamertemperatuur zijn en geen bijzondere voorwaarden voor postproductie, distributie of opslag3,4, vereisen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sappen is gemakkelijk te hanteren, wanneer gewenst; 3D gels kunnen eenvoudig worden verkregen doordat de Ionische sterkte of door aanpassing van de pH tot neutraliteit1,2. Tot slot, de hier beschreven methode is uitgebreid gebruikt in vitro ter bevordering van onderhoud, groei en differentiatie van een aantal celtypes, met inbegrip van chondrocyten hepatocyten endotheliale cellen, botcellen, neuronale cellen zo goed als embryonale en somatische stamcellen3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. in het huidige werk, beschrijven we het gebruik van een 3D-cultuur-systeem om te onderscheiden van menselijke uitgebreide articulaire chondrocyten (hACh) in kraakbeen-achtig weefsel als eerder beschreven11.
Hier is een methode cultuur cellen in een 3D-systeem met behulp van sappen beschreven. In deze synthetische biomaterial, worden cellen eerst gemengd met een peptide-oplossing, die vervolgens wordt geïnduceerd zelf monteren, oprichting van een netwerk van nanometric afmetingen rond de cellen en dus het creëren van een echt 3D omgeving (Figuur 1). Het is belangrijk om te overwegen dat cellulaire gedrag wordt beïnvloed door stijfheid matrixwaarden (dat wil zeggen, proliferatie, migratie en differentiatie). Daarom is een gemeenschappelijke methodologische besturingselement naar cultuur cellen op de top van de peptide steiger met de dezelfde waarden van de stijfheid (cultuur in twee dimensies).
Eerder, onze fractie en anderen hebben beschreef het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur platformen met uiteenlopende cel systemen3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. In het huidige werk, beschrijven we een gemakkelijke en betrouwbare methode voor het verkrijgen van 3D cultuur systemen die gelden voor elk type van zoogdiercellen met inbegrip van elk type van functionele cel, embryonaal of volwassen stamcellen, of uiteindelijk disfunctionele cellen geïsoleerd uit Biopten of tumoren, enzovoort. Daarnaast zelfstandig, zouden als stamcellen van embryonaal of volwassen oorsprong zijn zij hebben een betere lineage inzet capaciteit in de 3D-omgeving dan in klassieke 2D cultuur gerechten10,11,,12, 13,14,15. Daarom is de celcultuur in dit systeem zou leiden tot differentiatie in functionele weefsel-achtige structuren die kunnen worden gebruikt in verschillende toepassingen, gaande van herstellend of regeneratieve biologie naar toxicologische en farmacologische platformen.
Omdat de cellulaire communicatie vergelijkbaar met die van natuurlijke weefsels in termen van de basisstructuur en biomechanische, biofysische en biologische parameters is, hebben wij een duidelijke winst aangetoond in functie van de cel. Niettemin, aangezien het systeem steeds complexer, het aantal parameters die moeten worden geregeld ook toeneemt, waarin de noodzaak van een externe ondersteunende platform (zoals een actieve perfusie-systeem om massaoverdracht verschijnselen-geassocieerde problemen te voorkomen ). Ruimtelijk gekweekte cellen presteren beter op het gebied van de regulering van de essentiële activiteiten, zoals migratie, de proliferatie en differentiatie. Ze kunnen complexe netwerken waardoor verbeterde cellulaire Overspraak, die is veruit een onontbeerlijk gevolg van groeiende en differentiëren in 3D vormen. Het feit dat sappen kan leiden tot voorwaarden in vitro soortgelijk aan de extracellulaire matrix eiwitten vertegenwoordigt een voordeel sinds een rationele studie van het effect geproduceerd voor elk onderdeel toegevoegd aan de steiger (groeifactor, polysaccharide of signalering peptide) kan gemakkelijk plaatsvinden.
De duidelijke voordelen van het gebruik van sappen in vergelijking met andere natuurlijke steigers, zoals collageen type I en Matrigel, zijn de volgende: 1) sappen is een synthetische biomaterial met minimale variatie van batch tot batch productie; 2) sappen heeft het vermogen om te worden matiemaatschappij met specifieke peptide motieven; en 3) sappen presenteert lage biologische afbreekbaarheid in vitro, die het mogelijk het onderhoud van de 3D constructie met dezelfde biofysische, biomechanische en structurele eigenschappen na verloop van tijd maakt. Echter, de beperking van het gebruik van sappen versus andere steigers wordt gevonden tijdens de stap van de inkapseling, waar cellen in een vijandig milieu als gevolg van de lage pH. Daarom is dit een cruciale stap in de beschreven methodologie. Bovendien is het belangrijk om de concentratie van de sappen voor elke specifieke celtype vóór het begin van elke proef. Dit is in feite essentieel wanneer cellen worden gekweekt op of in deze biomaterialen, aangezien elke bepaald celtype optimale biomechanische groei omstandigheden zal presenteren.
Tenslotte menen wij dat het ontwerp en de fabricage van dit soort biomaterial steiger zou verbetering van de ontwikkeling van meer fysiologische en betrouwbare 3D weefsel modellen om te helpen de farmaceutische industrie te ontwikkelen beter therapeutische benaderingen voor regeneratieve geneeskunde, kanker of een medische behandeling.
The authors have nothing to disclose.
Het onderzoek uitgevoerd door de auteurs was gedeeltelijk gesteund door subsidies van de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder Grant overeenkomst nr. 229239, en van de AO Foundation, verkennend onderzoek Collaborative Research programma Acute Kraakbeen schade/letsel/Defect (CRP ACI) onder het project Bioactive en biomimetische steigers voor de regeneratie van de kraakbeen (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |