Summary

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l’imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l’invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l’efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Abstract

La sepsi è un tipo di infezione grave che può causare insufficienza d’organo e tessuto danni. Anche se i tassi di mortalità e morbilità associata a sepsi trattamento estremamente alto, nessun diretto o meccanismo di organo è stato esaminato in dettaglio in tempo reale. Il fegato è l’organo chiave che gestisce le tossine e le infezioni nel corpo umano. Nel presente documento, abbiamo mirato a eseguire imaging videomicroscopia del fegato del mouse dopo induzione di endotoxemia al fine di monitorare la motilità delle cellule immuni, quali neutrofili e macrofagi del fegato capsulari (LCMs). Di conseguenza, abbiamo progettato un nuovo metodo chirurgico per l’esposizione del fegato con la chirurgia mini-invasiva. Topi sono stati iniettati intraperitonealmente con il lipopolysaccharide (LPS), un comune dell’endotossina. Utilizzando il nostro nuovo approccio chirurgico per l’esposizione e l’imaging videomicroscopia del reclutamento del mouse del fegato, che abbiamo trovato che dei neutrofili in proteina fluorescente verde-LysM LPS-trattati (GFP) mouse del fegato è stato aumentato rispetto a quello in tampone fosfato fegato di salino-trattati. Dopo il trattamento LPS, il numero dei neutrofili è aumentato significativamente con tempo. Inoltre, con successo, utilizzando topi CX3Cr1-GFP, visualizzato macrofagi residenti del fegato chiamati LCMs. Pertanto, per studiare l’efficacia di nuovi reagenti per controllare la mobilità immuni in vivo, determinare la motilità e la morfologia dei neutrofili e LCMs nel fegato possono permetterci di identificare effetto terapeutico in organo fallimento e tessuto danni causati da attivazione di leucociti nella sepsi.

Introduction

Il fegato è l’organo metabolico principale nei mammiferi; Esso agisce come una torre di controllo per energia, ormoni e disintossicazione1. Grazie alla sua importanza, i ricercatori hanno condotto molti esperimenti in vitro e in vivo per delucidare i cambiamenti nel fegato durante l’infiammazione. La microscopia intravital è stata usata per catturare immagini in diretta dal fegato2 . Infatti, fegato vari metodi di formazione immagine sono stati introdotti2,3,4,5,6. Tuttavia, al fine di sviluppare un approccio chirurgico più semplificato e raggiungere la stabilizzazione dell’organo bersaglio e le cellule immunitarie, abbiamo progettato un semplice protocollo che possa guidare i ricercatori per ridurre al minimo il loro sforzo per videomicroscopia imaging.

In questo studio, abbiamo introdotto una camera di imaging stabile e romanzo e la tecnica chirurgica che possa essere utilizzata per ridurre al minimo il sanguinamento e possibili infezioni. Abbiamo confermato che il fegato è rimasta intatto per più di 2 h. Con questo metodo, abbiamo identificato correttamente morfologie di LCMs7 e neutrofili sotto condizione settica. Poiché questo metodo minimizza fisici e biologici fattori confondenti quali infiammazione tremante e imprevisto durante la procedura chirurgica, prevediamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato per osservare le reazioni acute di cellule immunitarie nel fegato in risposta a i reagenti come LPS.

Protocol

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteina fluorescente LysM-verde (GFP; gfp / +) topi8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +) topi9 a 8-12 settimane di età sono stati usati per l’imaging di videomicroscopia. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell’autoclave e disinfettato con alcol al 70%. 1. custom-designed mouse fegato imag…

Representative Results

Una camera semplice e molto stabile di imaging è stata ideata. Il fondo della camera era ricoperta di silicone, che ha impedito lo scivolamento del mouse corpo e organi. Inoltre, perché il silicio ha la giusta quantità di elasticità, potrebbe impedire danni attesi indotto dalla pressione della diapositiva coperchio (Figura 1A, C). Secondo, tessuto-cassaforte collante (Vet bond) è stato applicato al fine di risolvere il fegato estratto su…

Discussion

Il fegato è stato studiato attivamente da molti gruppi3,10, a causa dell’importanza della sua funzione. Per esempio, Heymann et al ha suggerito un metodo delicato utilizzando dell’agarosi. Anche se questo metodo è stato trovato per essere altamente precisi, l’impostazione di agarosio richiede tempo. Tuttavia, con la nostra metodologia, tutte le procedure possono essere effettuate entro 30 min, minimizzando altri fattori di confusione. In secondo luogo, il fegat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dalla nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo della Corea (MSIP; grant n. 2016R1A2B4008199 a Y-M. H.) e il Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI14C1324).

Materials

Custom designed chamber Live Cell Instruments Custom-designed size
Metal cover slide Live Cell Instruments Custom-designed size
Cover glass Electron Microscopy Sciences #72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning
Erlenmeyer flask DURAN 21 216 36
Cell culture plate (Flat type) HYUNDAI Micro Co. H31006
Desiccator ADARSH 55204
High Q BOND SE 5 mL BJM LAB To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters Omega SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply Toyotech DP30-03A
Phosphate-buffered saline Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis Sigma-Aldrich L6011
Texas Red Dextran Thermo Fisher Scientific D1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube
FALCON 14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) Sartorius 16555k
1.5ml Micro Tube, Amber Axygen MCT-150-X For light-blocking
1 mL syringe Korea Vaccine KV-S01
3 mL syringe Korea Vaccine KV-S03
10 mL syringe Korea Vaccine KV-S10
0.3 mL insulin syringe Becton Dickinson 324900
Hair removal cream 100 mL Body natur
Cotton swab ABDI
Zoletil 50 5 mL Virbac
Rompun 10 mL Bayer
Heating plate Live Cell Instruments PH-S-10 Custom-designed size
DC controller Live Cell Instruments CU-301
Microdessection Scissors Harvard Apparatus 72-5418
Scissors Roboz RS-5882
Forceps Roboz RS-5137
Vet bond 3M 1469SB
ZEN software (Black Edition) Carl Zeiss Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP Carl Zeiss
Volocity PerkinElmer Analysis program

References

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Cite This Article
Park, S. A., Choe, Y. H., Lee, S. H., Hyun, Y. Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver. J. Vis. Exp. (132), e57191, doi:10.3791/57191 (2018).

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