Size Matters: Mätning av kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

Som drabbar en kvarts miljon människor varje år och leder till mer än 180 000 dödsfall årligen, är Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulära jäst och vilka smittämnen av kryptokockos^{1,2, 3}. hårdast är HIV-positiva patienter i fattiga länder som inte har tillgång till antiretroviral behandling, vilket gör dem mycket mottagliga för den sjukdom^4,5,6. Data från CDC visar att i subsahariska Afrika, C. neoformans dödar fler människor än tuberkulos årligen och mer varje månad än någon ebolautbrottet på posten¹. Vanligaste exponeringsvägen uppstår från att andas in desiccated sporer som är vardagsmat i den miljö⁷. Ovanför inlåtande lungorna, finns det flera virulensfaktorer som bidrar till framgång för C. neoformans inom infekterade individer. Polysackarid kapseln anses mikrobs primära virulens faktor, som acapsular stammar inte är virulent⁸.

Cryptococcal kapseln består av tre principen komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), och mannoproteins (MPs)⁹. MPs är en relativt liten cellväggen-associerade komponent i kapseln, de är immunogena och kan främja en mestadels pro-inflammatoriska svar^9,10. Däremot GXM och GalXM utgör huvuddelen av kapseln (> 90% av vikten) och har immunsuppressiva effekter¹¹. Förutom dess immunmodulerande effekter skapar den snabba utvidgningen av kapsel i vivo en mekanisk barriär ingestion av värd Fagocytos celler (dvs, neutrofiler och makrofager)¹². C. neoformans kapseln och dess syntes är komplexa, men sammantaget ökade kapsel diameter är korrelerad med ökad virulens^6,13,14. Mot denna bakgrund är det viktigt för C. neoformans forskare att kunna snabbt och exakt kvantifiera kapsel mätningar.

Både C. neoformans cellen och dess polysackarid kapsel är dynamiska strukturer och visa förändringar över tid¹⁵. Kapseln kan ändra i densitet, storlek och montering som svar på förändringar i den mottagande miljö^16,17,18. Lågt järn eller näringsnivå, exponering för serum, människans fysiologiska pH och ökade CO₂ är kända för att initiera kapsel tillväxt^16,18,19,20. Dessutom har forskarna visat strukturförändringar som resulterar i betydande skillnader i immunoreaktivitet under en infektion, utlåning en fördel till C. neoformans över dess värd^21,22. Detta är känt eftersom arkitekturen av C. neoformans kapseln har analyserats i en mängd olika sätt. Elektronmikroskopi, exempelvis har avslöjat att kapseln har en heterogen matris med ett inre elektron-täta lager under en yttre, mer genomsläppliga lager²³. Ljusspridning och användning av optisk pincett låtit forskare att ytterligare klarlägga dess makromolekylära boenden²⁴. Analysera resultaten från både statiska och dynamiska ljusspridning mätningar, vet vi att den polysackarid kapseln har en komplex förgrenade struktur²³. Optisk pincett har använts för att testa styvhet struktur samt utvärdera dess antikropp reaktivitet²⁴. Särklass mest ofta sysselsatta analys av C. neoformans kapseln är dock mätningen av dess storlek.

För att kvantifiera kapsel storlek, forskare använder vad som borde vara en enkel mätning: linjär diametern på kapseln. Digitala Mikroskop används för att fånga bilder av flera C. neoformans celler (allmänt hundratals) färgas med tusch eller fluorescerande färgämnen. Varje cell kropp och omgivande kapsel storlek mäts. Uppgifterna sammanställs, och den genomsnittliga diametern av kapseln beräknas genom att subtrahera cellkroppen diameter från hela cellen diameter (cell kropp + kapsel). Fram till denna punkt, har dessa mätningar gjorts manuellt. Medan generellt korrekt, har denna metod nackdelar för forskare. Stora datamängder kan ta dagar eller veckor att analysera för hand. Och eftersom dessa mätningar sker manuellt, subjektivitet och mänskliga misstag kan påverka resultatet.

Automatiserad computational bildanalys har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare inom många områden i molekylär cellbiologi, möjliggör snabbare och mer tillförlitlig analys av biologiska bilder ^25,26,27. Exakt bild analystekniker är nödvändiga att gruvan kvantitativ information från vad är ofta komplexa och enorma datamängder. Vissa mätningar, särskilt mätning av C. neoformans kapsel, har dock svårt att automatisera. Att korrekt identifiera gränssnittet mellan cellväggen och kapsel, som allmänt visas som en mörk ring när fotograferad av faskontrast mikroskopi, kan vara besvärligt att lösa med hjälp av ett enkelt tröskelvärde. Ytterligare, C. neoformans celler i kultur tenderar att klumpa ihop och korrekt segmentering av cellerna är nödvändigt för noggranna mätningar.

Syftet med detta projekt var att a illustrera en av standardprotokollen för kapsel induktion i C. neoformans, (ii) jämför och kontrast India färgpulver och fluorescens färgning som de tillhör för att kapsel diameter mätningar, (iii) utveckla enkla, kalkylmässiga metoder att mäta kapsel diameter använder bilder av India färgpulver färgade celler med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys, och, (iv) bedöma fördelar och begränsningar för att mäta kapsel diameter manuellt och använda programvara automation. Vi finner att av de två färgning metoderna, fluorescerande märkning av cellväggen och kapsel, medan mer tidskrävande, gav de mest konsekventa resultat mellan experiment. Men båda metoderna aktiverat oss att framgångsrikt skilja mellan lab och kliniska C. neoformans kapsel stammar uppvisar olika storlekar. Vidare kunde vi automatisera mätning av kapsel diameter från India färgpulver målat bilder och fann att detta var ett lönsamt alternativ till manuell mätning av kapsel.