Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

Afetando um quarto de milhão de pessoas todos os anos e resultando em mais de 180.000 mortes por ano, o Cryptococcus neoformans é uma levedura patogénica, intracelular e o agente causador da criptococose,^{1,2, 3}. mais atingidas são os pacientes HIV-positivos em países pobres que não têm acesso à terapia anti-retroviral, tornando-os suscetíveis aguda para a doença^4,5,6. Dados do CDC indicam que na África subsahariana, c. neoformans mata mais pessoas do que a tuberculose anualmente e mais a cada mês do que qualquer surto de Ebola no registro¹. A via mais comum de exposição ocorre de inalar esporos dessecados que são comuns no ambiente⁷. Ao entrar nos pulmões, existem vários fatores de virulência que contribuem para o sucesso de c. neoformans dentro de indivíduos infectados. A cápsula de polissacarídeo é considerada fator de virulência primário do micróbio, acapsular cepas não são virulentas⁸.

A cápsula criptocócica é composta de três componentes do princípio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteins (MPs)⁹. Enquanto o MPs são um componente relativamente menor associada a parede celular da cápsula, são imunogênicas e podem promover uma resposta principalmente pro-inflamatórios^9,10. Em contraste, GXM e GalXM compõem a maior parte da cápsula (> 90% em peso) e tem efeitos imunossupressores¹¹. Além de seus efeitos imunomoduladores, o rápido alargamento da cápsula na vivo cria uma barreira mecânica à ingestão por células fagocíticas (isto é, neutrófilos e macrófagos) do hospedeiro¹². A cápsula de c. neoformans e sua síntese são complexas, mas em geral, maior diâmetro da cápsula está correlacionado com maior virulência^6,13,14. Diante disso, é importante para os investigadores de c. neoformans ser capaz de rapidamente e com precisão quantificar as medições da cápsula.

Tanto a célula de c. neoformans e sua cápsula de polissacarídeo são estruturas dinâmicas e mostram as mudanças ao longo do tempo,¹⁵. A cápsula pode mudar em conjunto em resposta a alterações na host ambiente^16,17,18, tamanho e densidade. Baixo ferro ou os níveis de nutrientes, a exposição ao soro, o pH fisiológico humano e aumento de CO₂ são conhecidos para iniciar o crescimento da cápsula^16,18,19,20. Além disso, pesquisadores demonstraram alterações estruturais, resultando em diferenças significativas na imunorreatividade durante uma infecção, emprestando uma vantagem para c. neoformans sobre seu hospedeiro^21,22. Isto é sabido porque a arquitetura da cápsula de c. neoformans foi analisada em uma variedade de maneiras. Microscopia eletrônica, por exemplo, revelou que a cápsula tem uma matriz heterogêneo com uma camada interna de elétron-densas debaixo de uma camada externa, mais permeáveis²³. Dispersão da luz e o uso de pinças ópticas permitiram pesquisadores elucidar ainda mais suas propriedades macromolecular²⁴. Analisar os resultados de ambas as medições estáticas e dinâmicas de espalhamento de luz, sabemos que a cápsula de polissacarídeo tem um complexo de estrutura ramificação²³. Pinça óptica têm sido utilizada para testar a rigidez da estrutura, bem como avaliar sua reatividade de anticorpos²⁴. No entanto, de longe o mais frequentemente empregado análise da cápsula de c. neoformans é a medida do seu tamanho.

Para quantificar o tamanho da cápsula, os pesquisadores utilizam o que deveria ser uma simples medição: o diâmetro linear da cápsula. Microscópios digitais são usados para capturar imagens de várias células de c. neoformans (geralmente centenas) manchadas com tinta nanquim ou corantes fluorescentes. O tamanho de cada corpo celular e cápsula circundante é medido. Os dados são compilados, e o diâmetro médio da cápsula é calculado subtraindo-se o diâmetro do corpo celular do diâmetro celular (corpo celular + cápsula). Até este ponto, estas medições foram feitas manualmente. Enquanto geralmente exato, este método tem desvantagens para os investigadores. Grandes conjuntos de dados pode demorar dias ou até semanas para analisar com a mão. E porque essas medições são feitas manualmente, subjetividade e erro humano podem afetar o resultado.

Análise de imagem computacional automatizado tornou-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores em muitas áreas da biologia celular molecular, permitindo a análise mais rápido e mais confiável de imagens biológicas ^25,26,27. Técnicas de análise de imagem precisas são necessárias informações quantitativas de que muitas vezes são conjuntos de dados complexos e imensos o meu. No entanto, algumas medidas, especialmente a medição de c. neoformans cápsula, foram difíceis automatizar. Identificar com precisão a interface entre a parede celular e cápsula, que geralmente aparece como um anel escuro quando imaginada por microscopia de contraste de fase, pode ser problemático para resolver usando um simples limite. Além disso, as células de c. neoformans em cultura tendem a aglutinar-se e segmentação exata das células é necessária para medições precisas.

O objetivo deste projeto foi (i) ilustram um dos protocolos padrão para a indução da cápsula em c. neoformans, (ii) compara e contrasta Nanquim e fluorescência de coloração como dizem respeito para a cápsula de medições de diâmetro, (iii) desenvolver simples, métodos computacionais para medir o diâmetro da cápsula usando imagens da Índia tinta manchada células usando um software de análise de imagem e, (iv) avaliam as vantagens e limitações de medir o diâmetro da cápsula manualmente e usando o software de automação. Podemos achar que os dois métodos de coloração, fluorescentes de rotulagem da parede celular e cápsula, enquanto mais demorados, forneceu os resultados mais consistentes entre experiências. No entanto, ambos os métodos permitiram-nos com sucesso a distinguir entre o laboratório e clínica c. neoformans cápsula de cepas exibindo diferentes tamanhos. Além disso, fomos capazes de automatizar a medição do diâmetro da cápsula de tinta manchada imagens e achei que se tratava de uma alternativa viável para medição manual da cápsula.