Summary

Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018
doi:

Summary

La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.

Abstract

La cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans es el factor de virulencia principal y uno de los más comúnmente estudiados aspectos de esta levadura patógena. Tamaño de la cápsula puede variar ampliamente entre cepas, tiene la capacidad de crecer rápidamente cuando introdujo a estrés o bajo condiciones de nutrientes y se ha correlacionado positivamente con la virulencia de la cepa. Por estas razones, el tamaño de la cápsula es de gran interés para los investigadores de C. neoformans . El crecimiento de la cápsula de C. neoformans es inducido durante la prueba fenotípica para ayudar a comprender los efectos de diferentes tratamientos sobre las diferencias entre cepas de levadura o el tamaño. Aquí describimos uno de los métodos estándar de cápsula inducción y comparar dos métodos aceptados de coloración y diámetro de la cápsula de medición: tinta de la India (i), una tinción negativa, utilizado conjuntamente con microscopía óptica convencional y (ii) Co la coloración con tintes fluorescentes de la pared celular y cápsula seguido por microscopia confocal. Por último, os mostramos cómo medida de diámetro cápsula de muestras manchadas de tinta de la India puede ser automatizado usando análisis de imagen Computacional.

Introduction

Afectando a un cuarto de millón de personas cada año y resultando en más de 180.000 muertes al año, Cryptococcus neoformans es una levadura patógena, intracelular y el agente causante de la criptococosis1,2, 3. más afectados son los pacientes VIH-positivos en los países pobres que no tienen acceso a tratamiento antirretroviral, lo que los hace muy susceptibles a la enfermedad4,5,6. Datos de los CDC indican que en el África subsahariana, C. neoformans mata más personas que la tuberculosis anualmente más cada mes y que cualquier brote de Ébola en el registro1. La vía más común de exposición ocurre por inhalación de esporas desecadas que son comunes en el medio ambiente7. Al entrar en los pulmones, hay varios factores de virulencia que contribuyen al éxito de C. neoformans en los individuos infectados. La cápsula de polisacárido se considera factor de virulencia principal del microbio, como acapsular cepas no virulentas8.

La cápsula de Cryptococcus se compone de tres componentes del principio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) y manoproteínas (MPs)9. Mientras que los diputados son un componente relativamente de menor importancia asociada a la pared celular de la cápsula, son inmunogénicos y pueden promover una respuesta sobre todo pro-inflamatoria9,10. Por el contrario, GXM y GalXM conforman la mayor parte de la cápsula (> 90% en peso) y tienen efectos inmunosupresores11. Además de sus efectos inmunomoduladores, la ampliación rápida de la cápsula en vivo crea una barrera mecánica a la ingestión por las células fagocíticas (es decir, neutrófilos y macrófagos) del anfitrión12. La cápsula de C. neoformans y la síntesis son complejas, pero en general, mayor diámetro cápsula se correlaciona con mayor virulencia6,13,14. Ante esto, es importante para los investigadores de C. neoformans ser capaces de forma rápida y precisa cuantificar las mediciones de la cápsulas.

Las células de C. neoformans y su cápsula de polisacáridos son estructuras dinámicas y muestran cambios en tiempo15. La cápsula puede cambiar en densidad, tamaño y montaje en respuesta a cambios en el entorno de host16,17,18. Hierro bajo o los niveles de nutrientes, exposición al suero, el pH fisiológico humano y aumento de CO2 se saben que iniciar crecimiento cápsula16,18,19,20. Además, los investigadores han demostrado cambios estructurales dando como resultado diferencias significativas en el immunoreactivity durante una infección, una ventaja a C. neoformans sobre su huésped los préstamos21,22. Esto se conoce porque la arquitectura de la cápsula de C. neoformans ha sido analizada en una variedad de maneras. Por ejemplo, microscopía electrónica, ha revelado que la cápsula tiene una matriz heterogénea con una capa interna de electrón-densos debajo de una capa externa, más permeable23. Dispersión de la luz y el uso de pinzas ópticas han permitido a los investigadores aclarar más lejos sus características macromoleculares24. Analizar los resultados de ambas mediciones de la dispersión ligera estática y dinámica, sabemos que la cápsula de polisacárido tiene una compleja ramificación de la estructura23. Pinza óptica se han utilizado para probar la rigidez de la estructura así como evaluar su reactividad anticuerpo del24. Sin embargo, el más frecuentemente empleado análisis de la cápsula de C. neoformans es la medida de su tamaño.

Para cuantificar el tamaño de la cápsula, los investigadores utilizan lo que debería ser una medida simple: el diámetro lineal de la cápsula. Microscopios digitales se utilizan para capturar imágenes de múltiples células de C. neoformans (generalmente cientos) teñidos con tinta china o con colorantes fluorescentes. Se mide el tamaño de cada cuerpo celular y la cápsula circundante. Los datos son compilados, y el diámetro medio de la cápsula se calcula restando el diámetro del cuerpo de la célula del diámetro entero de la célula (célula corporal + cápsulas). Hasta este punto, estas mediciones se han realizado manualmente. Mientras que generalmente precisa, este método tiene inconvenientes para los investigadores. Conjuntos de datos grandes puede tomar días o incluso semanas para analizar con la mano. Y ya que estas mediciones se hacen manualmente, subjetividad y el error humano pueden afectar el resultado.

Análisis de imagen Computacional automatizado se ha convertido en una herramienta indispensable para los investigadores en muchas áreas de la biología molecular de la célula, lo que posibilita un análisis más rápido y más fiable de imágenes biológicas 25,26,27. Técnicas de análisis de imágenes precisos son necesarias para extraer información cuantitativa de lo que a menudo son complejos e inmensos conjuntos de datos. Sin embargo, algunas medidas, especialmente la medición de la cápsula de C. neoformans , han sido difíciles de automatizar. Identificar con precisión la interfaz entre la pared celular y cápsula, que generalmente aparece como un anillo oscuro cuando imágenes por microscopia de contraste de fase, puede ser problemática a resolver mediante un simple umbral. Además, las células de C. neoformans en cultivo tienden a agruparse y precisa segmentación de las células es necesario para las medidas exactas.

El objetivo de este proyecto fue para (i) ilustrar uno de los protocolos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans, (ii) Comparar y contrastar la tinta India y tinción de fluorescencia relativas para mediciones del diámetro de la cápsula (iii) desarrollar simple, métodos computacionales para medir diámetro cápsula utilizando imágenes de tinta de la India manchadas las células usando un software de análisis de imagen y, (iv) evaluación los beneficios y limitaciones de diámetro de la cápsula de medición manualmente y utilizando la automatización del software. Encontramos que de los dos métodos de tinción, fluorescentes de la pared celular y cápsula, mientras más desperdiciadores de tiempo, proporciona los resultados más consistentes entre experimentos. Sin embargo, ambos métodos nos permitieron distinguir correctamente entre laboratorio y clínica C. neoformans exhibe diferentes cepas cápsula tamaños. Además, fuimos capaces de automatizar la medición de diámetro cápsula de tinta manchada imágenes y encontró que ésta era una alternativa viable para medición manual de la cápsula.

Protocol

Nota: C. neoformans es un patógeno de bioseguridad nivel 2 (BSL-2) y los investigadores que trabajan con él deben tomar las precauciones adecuadas. Procedimientos detallados sobre cómo con seguridad trabajo con patógenos de BSL-2 se encuentra en el centro for Disease Control (CDC) sitio web, pero es importante tener en cuenta que todas las personas que entran en contacto con C. neoformans deben ser debidamente entrenadas en el manejo de agentes patógenos y deben usar siempre equipo de protección p…

Representative Results

Para ilustrar la cápsula inducción celular tinción, proyección de imagen y técnicas de medición, se utilizaron tres cepas de neoformans de la C.: colar el laboratorio común, bien caracterizado, H99S30y dos cepas clínicamente aisladas de previamente diámetro cápsula desconocido, B18 y B5231. El flujo de trabajo de inducción cápsula, tinción y adquisición de la…

Discussion

Durante décadas, la cápsula ha sido un importante foco de investigación para micólogos y médicos interesados en C. neoformans y criptococosis debido a su papel como factor de virulencia importante para el patógeno. Mediante microscopía para medir diferencias en el tamaño de la cápsula entre cepas y bajo crecimiento diferentes condiciones pueden proporcionar información importante sobre el patógeno y sus respuestas a varios estímulos(es decir, diferentes condiciones ambientales, posibles trat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al programa de doctorado de biociencias moleculares (MOBI) y el Departamento de biología en Tennessee medio estado Universidad (MTSU) para proporcionar el financiamiento para este estudio. El proyecto también fue financiado en parte por una subvención de proyectos especial concedida al D.E.N. de la Fundación de MTSU.

Materials

Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

References

  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O’Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. . . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Play Video

Cite This Article
Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

View Video