Summary

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018
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Summary

Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.

Abstract

Die Polysaccharid-Kapsel von Cryptococcus Neoformans ist die primäre Virulenzfaktor und eines der wichtigsten Aspekte dieser Pathogene Hefe allgemein untersucht. Kapsel Größe kann sehr unterschiedlich zwischen den Stämmen, hat die Fähigkeit, schnell zu wachsen, wenn Stress oder niedrigen Nährstoffverhältnisse eingeführt und wurde positiv korreliert mit Stamm Virulenz. Aus diesen Gründen ist die Größe der Kapsel von großem Interesse für C. Neoformans Forscher. Das Wachstum der C. Neoformans Kapsel induziert wird während der phänotypischen Tests, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf der Hefe oder Größe Unterschiede zwischen Stämmen zu verstehen. Hier beschreiben wir eine der Standardmethoden der Kapsel Induktion und vergleichen zwei anerkannten Methoden der Färbung und Messung Kapseldurchmesser: (i) Tusche, einen negativen Fleck, verwendet in Verbindung mit konventionellen Lichtmikroskopie und Färbung (Ii) zusammen mit fluoreszierende Farbstoffe der Zellwand und Kapsel gefolgt von konfokalen Mikroskopie. Endlich, wir zeigen, wie Messung der Kapseldurchmesser aus Indien blau gefärbten Proben mittels computergestützten Bildanalyse automatisiert.

Introduction

Jedes Jahr eine Viertel Million Menschen betroffen, und was mehr als 180.000 Todesfälle jährlich, ist Cryptococcus Neoformans , Pathogene, intrazelluläre Hefe und dem Erreger der Kryptokokkose1,2, 3. am stärksten betroffen sind HIV-infizierte Patienten in armen Ländern, die nicht Zugang zu antiretroviralen Therapie, so dass sie sehr anfällig für die Krankheit4,5,6. Daten aus der CDC zeigen, dass in Subsahara-Afrika, C. Neoformans mehr Menschen als durch Tuberkulose jährlich und mehr pro Monat als jede Ebola-Ausbruch auf Rekord1tötet. Der häufigste Weg der Exposition erfolgt durch das Einatmen von ausgetrockneten Sporen, die in der Umwelt7Gang und gäbe sind. Beim Betreten der Lunge, gibt es mehrere Virulenzfaktoren, die zum Erfolg von C. Neoformans innerhalb von infizierten Personen beitragen. Die Polysaccharid-Kapsel ist die Mikrobe primäre Virulenzfaktor, als Acapsular Stämme nicht virulente8sind.

Die Cryptococcus Kapsel besteht der drei Hauptkomponenten: Glucuronoxylomannan (GXM), Galactoxylomannan (GalXM) und Mannoproteins (MPs)9. Während MPs eine relativ geringe Zellwand-assoziierte Komponente der Kapsel sind, sie sind immunogen und vor allem Pro-inflammatorische Reaktion9,10fördern können. Im Gegensatz dazu GXM und GalXM machen den größten Teil der Kapsel (> 90 % nach Gewicht) und immunsuppressive Effekte11haben. Neben seiner immunmodulatorische Effekte schafft die rasche Erweiterung der Kapsel in Vivo eine mechanische Barriere zur Einnahme von Host phagocytic Zellen (d.h., neutrophilen Granulozyten und Makrophagen)12. C. Neoformans Kapsel und seine Synthese sind komplex, aber insgesamt, erhöhte Kapseldurchmesser korreliert mit erhöhter Virulenz6,13,14. Angesichts dieser Tatsache ist es wichtig für C. Neoformans Forscher in der Lage sein, schnell und präzise Kapsel Messungen zu quantifizieren.

C. Neoformans Zelle und seine Polysaccharid-Kapsel sind dynamische Strukturen und Veränderungen über Zeit15zeigen. Die Kapsel kann in Dichte, Größe und Montage als Reaktion auf Änderungen in der Host-Umgebung16,17,18ändern. Eisenarme oder Nährstoffgehalt, Exposition gegenüber Serum, die menschlichen physiologischen pH-Wert und erhöhte CO2 sind bekannt, Kapsel Wachstum16,18,19,20zu initiieren. Darüber hinaus haben Forscher gezeigt, strukturelle Veränderungen zu erheblichen Unterschieden bei der Immunoreactivity während einer Infektion, Kreditvergabe einen Vorteil zu C. Neoformans gegenüber seinen Wirt21,22. Dies ist bekannt, weil die Architektur der C. Neoformans Kapsel in eine Vielzahl von Möglichkeiten analysiert wurde. Elektronenmikroskopie, hat beispielsweise ergeben, dass die Kapsel eine heterogene Matrix mit einer inneren Elektron-dichte Schicht unter einer äußeren, durchlässiger Schicht23 hat. Lichtstreuung und die Verwendung von optischen Pinzette konnten Forscher der makromolekularen Eigenschaften24weiter aufzuklären. Analyse der Ergebnisse aus beiden Messungen statische und dynamische Lichtstreuung, wissen wir, dass die Polysaccharid-Kapsel einen komplexen verzweigten Struktur23 hat. Optische Pinzette wurden zur Testen der Steifigkeit der Struktur sowie die Bewertung ihrer Antikörper Reaktivität24. Allerdings ist bei weitem die am häufigsten eingesetzten Analyse der C. Neoformans Kapsel die Messung seiner Größe.

Quantifizierung der Kapsel Größe Forscher nutzen, was eine einfache Messung sein sollte: die lineare Durchmesser der Kapsel. Digitale Mikroskope werden verwendet, um Bilder von mehreren Zellen in C. Neoformans (in der Regel Hunderte) mit Tusche oder Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt zu erfassen. Die Größe der einzelnen Zelle Körper und umgebenden Kapsel wird gemessen. Die Daten werden zusammengestellt, und der mittlere Durchmesser der Kapsel wird durch Subtrahieren des Zellkörper Durchmesser aus der ganzen Zelle Durchmesser (Zellkörper + Kapsel) berechnet. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden diese Messungen manuell durchgeführt. Obwohl in der Regel genau, hat diese Methode Nachteile für Forscher. Großer Datenmengen können Tage oder sogar Wochen, von hand zu analysieren. Und da diese Messungen manuell erfolgen, Subjektivität und menschliches Versagen das Ergebnis beeinflussen können.

Automatisierte, computergestützte Bildanalyse ist ein unverzichtbares Werkzeug für Wissenschaftler in vielen Bereichen der molekularen Zellbiologie, ermöglicht schnellere und zuverlässigere Analyse von biologischen Bilder 25,26,27geworden. Genaues Bild-Analyse-Techniken sind notwendig, um quantitative Informationen aus was oft komplex und immense Datenmengen sind von mir. Allerdings wurden einige Messungen, insbesondere die Messung der C. Neoformans Kapsel, schwer zu automatisieren. Genaue Identifizierung der Schnittstelle zwischen der Zellwand und der Kapsel, die in der Regel als einen dunklen Ring, wenn Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet angezeigt wird, kann zur Lösung mit einem einfachen Schwellenwert lästig sein. Weitere, C. Neoformans Zellen in Kultur tendenziell verklumpen und genaue Segmentierung der Zellen ist notwendig für genaue Messungen.

Das Ziel dieses Projektes war es, (i) eines der Standardprotokolle für Kapsel Induktion in C. Neoformans (Ii) vergleichen und Tusche zu veranschaulichen und Fluoreszenz Färbung wie sie betreffen um Durchmesser Messungen, Kapsel (Iii) entwickeln einfache, Berechnungsmethoden Kapseldurchmesser mit Bildern von Tusche gefärbten Zellen mit einer Bildanalyse-Software und (iv) messen bewerten die vor- und Nachteile Kapseldurchmesser manuell messen und mithilfe der Automatisierung von Software. Wir finden, dass die beiden Färbung Methoden, fluoreszierende Kennzeichnung der Zellwand und Kapsel, während mehr Zeit in Anspruch, die konstantesten Ergebnisse zwischen Experimente. Aber beide Methoden konnten wir erfolgreich zu unterscheiden zwischen Labor und klinische C. Neoformans Kapsel Stämme mit verschiedenen Größen. Darüber hinaus konnten wir die Messung der Kapseldurchmesser von Tusche gefärbten Bilder zu automatisieren und fand, dass dies eine echte Alternative zur manuellen Messung der Kapsel.

Protocol

Hinweis: C. Neoformans ist ein Biosafety Level 2 (BSL-2) Erreger und Forscher arbeiten müssen angemessene Vorsichtsmaßnahmen ergreifen. Verfahren detailliert auf wie zu sicher Arbeit mit BSL-2 Krankheitserreger auf das Center for Disease Control (CDC) gefunden werden kann Website, aber es ist wichtig zu beachten, dass alle Personen, die Kontakt mit C. Neoformans im Umgang geschult werden sollte Krankheitserreger und sollte immer tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), in der Regel Lat…

Representative Results

Zur Veranschaulichung der Kapsel Induktion, Zelle Färbung, Bildverarbeitung und Messtechnik verwendet wir drei Stämme von C. Neoformans: das gemeinsame, gut charakterisierte Labor Stamm, H99S30und zwei klinisch isolierten Stämme der zuvor unbekannte Kapseldurchmesser, B18 und B5231. Abbildung 1Azeigt der Workflow der Kapsel Induktion, Färb…

Discussion

Die Kapsel ist seit Jahrzehnten ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung für Mykologen und Kliniker C. Neoformans und Kryptokokkose wegen seiner Rolle als Virulenzfaktor der großen der Erreger interessiert. Mit Mikroskopie zu können messen Kapsel Größenunterschiede zwischen den Stämmen und unter verschiedenen Wachstum Bedingungen wichtigen Informationen über den Erreger und seine Reaktionen auf verschiedene Reize (z.B. unterschiedliche Umweltbedingungen mögliche medikamentöse Behandlungen, e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der molekularen Biowissenschaften (MOBI) Doktorat und die Biologie-Abteilung am Middle Tennessee State University (MTSU) für die Bereitstellung der Mittel für diese Studie. Das Projekt wurde auch teilweise durch eine spezielle Projekte Stipendium, D.E.N. die MTSU Foundation finanziert.

Materials

Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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