Summary

Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018
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Summary

La capsule de polysaccharide est le facteur de virulence primaire à Cryptococcus neoformans, et sa taille est corrélé avec la virulence de la souche. Mesures de diamètre capsule sont utilisées dans les tests phénotypiques et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Une méthode standard d’induction capsule est présentée ici, et on a comparé deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre.

Abstract

La capsule de polysaccharide de Cryptococcus neoformans est le facteur de virulence primaire et un des plus couramment étudié les aspects de cette levure pathogène. Taille de la capsule peut varier considérablement entre les souches, a la capacité de croître rapidement lorsque vorstellen conditions nutritives stressantes ou faibles et a été positivement corrélée avec la virulence de la souche. Pour ces raisons, la taille de la capsule est d’un grand intérêt pour les chercheurs de c. neoformans . La croissance de la capsule de c. neoformans est induite pendant le test phénotypique pour aider à comprendre les effets des différents traitements sur les différences de levure ou de taille entre les souches. Nous décrivons ici une des méthodes standards de capsule induction et comparer deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre de la capsule : (i) de l’encre de Chine, un colorant négatif, utilisé en conjonction avec la microscopie optique conventionnelle et (ii) coloration conjointement avec colorants fluorescents de la paroi cellulaire et capsule suivie par microscopie confocale. Enfin, nous montrons comment la mesure du diamètre capsule des échantillons colorés à l’encre de Chine peut être automatisé en utilisant l’analyse de l’image numérique.

Introduction

Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose1,2, 3. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne, c. neoformans tue plus de personnes que la tuberculose chaque année et plus chaque mois à une épidémie d’Ebola sur record1. La voie d’exposition la plus courante se produit à l’inhalation de spores desséchés qui sont monnaie courante dans l’ environnement7. En entrant dans les poumons, il y a plusieurs facteurs de virulence qui contribuent au succès de c. neoformans chez les individus infectés. La capsule polysaccharidique est considérée comme facteur de virulence primaire de microbe, que capsulée souches non virulentes8.

La capsule cryptococcique se compose de trois éléments de principe : glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) et mannoprotéines (MPs)9. Alors que les députés sont une composante relativement mineure d’associée à la paroi cellulaire de la capsule, ils sont immunogènes et peuvent favoriser une réponse essentiellement pro-inflammatoire9,10. En revanche, les GXM et GalXM forment l’essentiel de la capsule (> 90 % en poids) et ont des effets immunosuppressifs11. Outre ses effets immunomodulateurs, l’élargissement rapide de la capsule en vivo crée une barrière mécanique à l’ingestion par l’hôte des cellules phagocytaires (c.-à-d., des neutrophiles et macrophages)12. La capsule de c. neoformans et sa synthèse sont complexes, mais dans l’ensemble, une augmentation de diamètre capsule est corrélée avec une virulence accrue de13,6,14. Ceci étant, il est important pour les chercheurs de c. neoformans pouvoir rapidement et précisément quantifier les mesures capsules.

La cellule c. neoformans tant sa capsule de polysaccharide sont des structures dynamiques et montrent des changements au fil du temps15. La capsule peut changer dans la densité, la taille et l’Assemblée en réponse aux changements dans l’hôte environnement16,17,18. Faible teneur en fer ou niveaux d’éléments nutritifs, exposition au sérum, le pH physiologique humain et une augmentation du CO2 sont connus pour ouvrir la capsule croissance16,18,19,20. En outre, les chercheurs ont montré des changements structurels, ce qui entraîne des différences significatives dans l’immunoréactivité lors d’une infection, prêt un avantage à c. neoformans sur son hôte21,22. Ceci est connu parce que l’architecture de la capsule de c. neoformans a été analysée dans une variété de façons. Microscopie électronique, par exemple, a révélé que la capsule a une matrice hétérogène avec une couche interne dense aux électrons sous une couche extérieure, plus perméable23. Diffusion de la lumière et l’utilisation de pinces optiques ont permis aux chercheurs d’élucider davantage ses propriétés macromoléculaires24. Analyse des résultats de ces deux mesures de diffusion de la lumière statique et dynamique, nous savons que la capsule polyosidique a un complexe de la structure ramification23. Des pinces optiques ont été utilisés pour tester la rigidité de la structure mais aussi à évaluer son anticorps réactivité24. Cependant, l’analyse de loin le plus souvent indépendants de la capsule de c. neoformans est la mesure de sa taille.

Afin de quantifier la taille de la capsule, les chercheurs utilisent ce que devrait être une mesure simple : le diamètre linéaire de la capsule. Microscopes numériques sont utilisées pour capturer des images de plusieurs cellules de c. neoformans (généralement des centaines) colorés avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents. La taille de chaque corps cellulaire et de la capsule environnante est mesurée. Les données sont compilées, et le diamètre moyen de la capsule est calculé en soustrayant le diamètre du corps cellulaire du diamètre à germes entiers (corps cellulaire + capsule). Jusqu’à présent, ces mesures ont été faites manuellement. Bien que généralement exacte, cette méthode a des inconvénients pour les chercheurs. Ensembles de données volumineux peut prendre des jours ou même des semaines pour analyser à la main. Et parce que ces mesures sont effectuées manuellement, la subjectivité et l’erreur humaine peuvent affecter le résultat.

Analyse d’image informatique automatisé est devenu un outil indispensable pour les chercheurs dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire, permettant une analyse plus rapide et plus fiable des images biologiques 25,26,27. Techniques d’analyse précise de l’image sont nécessaires pour extraire des informations quantitatives de ce qui sont souvent des ensembles de données complexes et immenses. Toutefois, certaines mesures, notamment la mesure de la capsule de c. neoformans , été difficiles à automatiser. Identifier avec précision l’interface entre la paroi cellulaire et de la capsule, qui apparaît généralement comme un anneau sombre lorsqu’imagée par microscopie à contraste de phase, peut être gênante résoudre à l’aide d’un simple seuil. En outre, les cellules en culture de c. neoformans ont tendance à s’agglomérer et segmentation précise des cellules est nécessaire pour des mesures précises.

Ce projet vise à (i) illustrent un des protocoles standards pour capsule induction dans c. neoformans, (ii) comparer et contraster l’encre de Chine et coloration de fluorescence en ce qui concerne pour capsule mesures de diamètre, (iii) développer simple, méthodes de calcul pour mesurer le diamètre capsule à l’aide d’images d’encre teinté de cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse image et, (iv) évaluent les avantages et les limites de mesure diamètre capsule manuellement et à l’aide d’automation de logiciel. Nous conclure que les deux méthodes de coloration, fluorescent d’étiquetage de la paroi cellulaire et de la capsule, alors que plus de temps, a fourni les résultats les plus cohérents entre les expériences. Toutefois, les deux méthodes nous a permis de distinguer avec succès entre le laboratoire et clinique c. neoformans souches présentant différents capsule tailles. En outre, nous avons pu automatiser la mesure du diamètre capsule de l’encre de Chine coloré des images et trouvé que c’était une alternative viable à la mesure manuelle de la capsule.

Protocol

Remarque : C. neoformans est un pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et les chercheurs qui travaillent avec elle doivent prendre des précautions appropriées. Des procédures détaillées sur comment à en toute sécurité travail avec BSL-2 pathogènes se trouvent sur le Center for Disease Control (CDC), site Web, mais il est important de noter que toutes les personnes entrant en contact avec c. neoformans soient correctement formés à la manipulation agents pathogènes et doivent toujour…

Representative Results

Pour illustrer la capsule induction, coloration de la cellule, imagerie et techniques de mesure, nous avons utilisé trois souches de c. neoformans : souche le laboratoire commun, bien caractérisé, H99S30, ainsi que deux souches isolées sur le plan clinique de précédemment diamètre capsule inconnue, B18 et B5231. Le workflow de capsule induction, coloration et acqui…

Discussion

Pendant des décennies, la capsule a été un élément majeur de la recherche pour les mycologues et les cliniciens intéressés par c. neoformans et cryptococcose en raison de son rôle comme un facteur de virulence important pour l’agent pathogène. En utilisant la microscopie à mesurer les différences dans la taille de la capsule entre les souches et en vertu de la croissance de différente conditions peuvent fournir des informations importantes concernant l’agent pathogène et ses réponses aux divers…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le programme doctoral de Biosciences moléculaires (MOBI) et le département de biologie à Middle Tennessee State University (MTSU) pour assurer le financement de cette étude. Le projet est également financé en partie par une subvention de projets spéciaux à recevoir par la Fondation MTSU.

Materials

Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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