Les méthodes traditionnelles d’évaluation de la différenciation adipocytaire sont bon marché et facile à utiliser, mais ne sont pas spécifiques aux changements dans l’expression des gènes. Nous avons développé un test afin de quantifier la différenciation des cellules mésenchymateuses en adipocytes matures à l’aide d’un marqueur spécifique de la lignée. Ce dosage a diverses applications dans la recherche fondamentale et de la médecine clinique.
Plusieurs colorants sont actuellement disponibles pour utilisation dans la détection de différenciation des cellules mésenchymateuses en adipocytes. Teintures, tels que l’huile rouge O, sont bon marché, facile à utiliser et largement utilisés par les laboratoires analysant le potentiel adipocytaire de cellules mésenchymateuses. Toutefois, ils ne sont pas spécifiques à l’évolution de la transcription du gène. Nous avons développé un test de différenciation de gène-spécifique pour analyser quand une cellule mésenchymateuse a passé son sort à une lignée adipocytaire. Immuno-étiquetage contre l’acide gras liaison protéine-4 (FABP4), un marqueur spécifique à la lignée de la différenciation adipocytaire, activé la visualisation et la quantification des cellules différenciées. La capacité de quantifier le potentiel de différenciation adipocytaire de cellules mésenchymateuses dans un format 96 puits microplaque influe prometteur pour un certain nombre d’applications. Des centaines d’essais cliniques impliquent l’utilisation de cellules stromales mésenchymateuses adultes et il est actuellement difficile de corréler les résultats thérapeutiques au sein et en particulier entre ces essais cliniques. Ce dosage simple de FABP4 haut débit fournit un test quantitatif pour évaluer le potentiel de différenciation des cellules dérivées de patient et est un outil robuste pour comparer les différentes méthodes d’isolement et d’expansion. Ceci est particulièrement important compte tenu de la reconnaissance croissante de l’hétérogénéité des cellules étant administré à des patients en produits de cellules mésenchymateuses. L’essai a aussi utilité potentielle dans le dépistage des drogues à haut débit, notamment dans la recherche de l’obésité et le pré-diabète.
Une des exigences clés mis en place par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT) pour définir une cellule stromale mésenchymateuse multipotente est que les cellules doivent avoir la capacité de se différencier en l’adipocytaire, ostéogénique et lignées chondrogéniques 1. les méthodes conventionnelles de différenciation en ces trois lignées de mesure s’appuient sur la détection de produits macromoléculaires à l’aide de teintures chimiques1. Colorants tels que Oil Red O (dont les taches des gouttelettes de graisse dans les cellules qui ont subi l’adipogenèse), sont bon marché et facile à utiliser ; Toutefois, ils ne parviennent pas à détecter les changements précis dans l’expression des gènes qui se produisent lorsque les cellules mésenchymateuses se différencient en chaque lignage respectives2. Ici, nous avons mis au point un test de différenciation qui quantifie l’expression de la protéine à un marqueur de lignée spécifique adipocytaire, liant les acides gras protéine-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 se trouvait initialement dans murin 3 t 3-L1 adipocytes3 et découvrit plus tard de s’exprimer dans les tissus adipeux sous-cutanés6. C’est une protéine cytosolique, qui agit comme un chaperon pour guider l’absorption des acides gras par les cellules et est impliqué dans le processus de lipolyse4.
Les cellules précurseurs utilisés pour les tests de différenciation ont été adipeux cellules stromales mésenchymateuses dérivées (ASCs)7,8. ASCs partagent de nombreuses propriétés avec moelle osseuse cellules souches mésenchymateuses (BM-CSM), une population de grandes cellules souches mésenchymateuses adultes8,9. ASCs offrent plusieurs avantages sur BM-MSCs dans une application clinique, comme le plus grand rendement de cellules peut être isolée de tissus plus accessibles des sources8,9. Une population de cellules isolées doit répondre à certains critères pour être défini comme l’ASCs. Tout d’abord, elles doivent montrer respect des récipients de culture de tissu en plastique dans des conditions de culture standard1. Elles doivent aussi montrer l’antigène de surface spécifique expression1. ASCs incultes sont caractérisées par l’expression de l’antigène de surface positif de CD34, CD73, CD90, faible expression du CD105 et négative expression de CD45 et HLA-DR10. ASCs purifiées en cultivant sur le plastique pendant 28 jours (adhérent purifiée ASCs) montrent une expression positive de CD73, CD90 et CD105 et expression négative de CD34, CD45 et HLA-DR10. Enfin, les cellules doivent conserver la capacité de se différencier en différents lignages1,7,8.
Protocoles de différenciation adipocytaire induisent upregulation saisissante d’expression FABP4 parmi les autres gènes de lignée adipocytaire, donc nous immunochimie permettant de visualiser FABP4 protéine dans les cellules et ensuite quantifié FABP4 expression au niveau de la cellule unique en utilisant un microscope de dépistage automatisé à haute teneur fluorescent. Cette méthode est avantageuse sur teintures traditionnelles car elle permet la confirmation très spécifique de la différenciation adipocytaire lignée. Ces tests de lignée spécifique de gène combinées à haute teneur également les méthodes de dépistage permettent de quantifier la proportion de cellules au sein d’une préparation de cellules hétérogènes qui sont capables de différenciation vers le bas une lignée particulière. Dans nos études, nous avons utilisé le test FABP4 pour confirmer la perte de potentiel de différenciation adipocytaire des CRA fraîchement isolées après culture cellulaire.
Cet article démontre l’utilité et les avantages de FABP4 immunomarquage avec précision détecter et quantifier des adipocytes matures dérivées de cellules stromales mésenchymateuses. FABP4 est capable de détecter des changements dans l’expression d’un lignage protéine spécifique3,4,5 dans les adipocytes matures, contrairement aux autres communément utilisé des colorants quelle étiquette macromoléculaire change13,14 comme Oil Red O15, Nil rouge16 et noir Soudan17. FABP4 immunomarquage permettant la visualisation et l’analyse des changements dans la morphologie cellulaire. Il s’agit d’un avantage distinctif par rapport aux méthodes décrites précédemment à l’aide de la transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) qui analyse les changements au niveau de la transcription sans aucune visualisation5,18,19 ,20, ou écoulement cytometry nécessitant des cellules en suspension20ou Western Blot qui fonctionne avec pour être lysées pour isoler les protéines19,20. FABP4 immunomarquage est stable dans les cellules fixes, ne fuit pas en solution et étant une protéine cytosolique quand étiquetés d’une monocouche adhérente des cellules, se chevauchent avec le noyau permettant une visualisation facile et ajouté la précision dans l’analyse automatique.
Dépistage de haute teneur est avantageuse, car il est rapide, précis, reproductible et objective. Il fournit une plate-forme pour une utilisation rentable des réactifs et temps de chercheur, puisque analyse et acquisition d’images exigent une manipulation manuelle minimale et s’appuient sur le traitement automatique de l’instrument. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme essentiels à la précision et la reproductibilité de la projection de haute teneur dosages31. La quantification de l’expression de l’antigène s’appuie sur la qualité de l’image. Pour l’analyse des images réussies, images de chaque canal par puits doivent être mise au point et relèvent d’une dynamique optimale pour les valeurs de gris (paramètres Auto exposer sont idéales). Sortie de focus ou saturée d’images conduisent à des résultats erronés.
Certaines limites possibles des méthodes décrites dans cet article sont les suivants. L’obligation pour le logiciel spécialisé de matériel et d’analyse d’imagerie. En dehors de la portée du présent article, les options logicielles alternatives open source (par exemple, ImageJ,32,33, Fidji34, CellProfiler32,35) peuvent être utilisées pour effectuer la segmentation d’images similaires tâches ; Toutefois, ils nécessitent les compétences nécessaires pour télécharger et adapter des macros disponibles en ligne ou écrire des macros/commandes pour leurs pipelines d’analyse spécifique. Un niveau de bruit de fond est inhérent aux pipelines tous automatisés d’analyse d’imagerie. Cela est attribuable en grande partie aux débris, image mauvaise qualité analyse erreur ou, en insistant sur la nécessité d’une préparation attentive et minutieuse mise en place de la plateforme d’imagerie et d’analyse. L’étiquette de FABP4 chez la souris a été trouvé pour détecter les cellules souches indifférenciées,30; alors que les contrôles dans cette étude (qui se composent de cellules indifférenciées) sont dépourvues de coloration spécifique de FABP4. Ce scores sous la nécessité d’archiver les FABP4 expression indifférencié progéniteurs dans chaque contexte biologique où l’essai est employé.
Afin d’établir des comparaisons valables entre l’étiquetage FABP4 et Oil Red O coloration, les mesures de sortie de l’analyse de l’image devait être biologiquement pertinente. Par conséquent, la mesure, « % des cellules positives » a été utilisée pour FABP4, et « zone de coloration par cellule » a été utilisé pour l’huile rouge O. Il est à noter que la mesure « % des cellules positives » n’était pas utilisée pour Oil Red O étiquetés cellules dans notre étude, parce qu’il n’était pas possible d’attribuer les gouttelettes de gras marqués avec précision à un noyau donné ; les gouttelettes de matière grasses varient considérablement en taille, nombre et répartition à travers le corps de la cellule et se chevauchent rarement avec le noyau. Oil Red O coloration variabilité existe entre les cellules provenant de tissus différentes sources ; alors que le % positive cellules mesure n’était pas approprié pour la présente étude, un autre groupe a utilisé avec succès pour quantifier les adipocytes provenant de cellules souches humaines glande22 où la coloration à l’huile rouge O est apparue comme une grosses gouttelettes de graisses qui s’étend sur le cytoplasme et superposées avec des noyaux et porteur de données soient présentées comme des cellules positives %.
En revanche, la morphologie des FABP4 immunomarquage Concorde dans les adipocytes provenant d’une gamme de tissus de différentes sources23,24,25. La capacité de quantifier la proportion de cellules au sein d’une culture capable de différenciation a un certain nombre d’applications. Cellules stromales mésenchymateuses adultes significatifs semblent prometteurs pour un large éventail d’utilisations thérapeutiques. Une question importante qui a surgi avec la traduction clinique est la variabilité inhérente à la capacité de ces cellules entre patients26, entre les sites d’isolement27,28et entre les méthodes d’isolement12 et l’expansion des cellules numéros12 pour un usage thérapeutique. Il a été démontré précédemment que les cultures de cellules stromales adhérentes sont fréquemment hétérogènes, avec quelques cellules capables de différenciation et d’autres non 12,17 , comme notre FABP4 dosage montre pour les cultures de l’ASC. Dosages comme ceci, combiné avec des techniques d’enrichissement, permettra d’identifier les sous-populations au sein de cultures hétérogènes capables de différenciation de la lignée spécifique. Avoir un test standardisé, quantifiable tels que cet essai de FABP4 fournit une méthode simple pour la comparaison entre toutes ces variables et la possibilité d’évaluer des résultats thérapeutiques dans et entre les essais cliniques.
La quantification des FABP4 de façon semi-automatique permet d’objectivité et la reproductibilité dans l’analyse à travers de nombreux cas, donateurs et échantillons. En outre que l’étiquette est cytoplasmique, il peut être éventuellement utilisé pour analyser l’hypertrophie (élargissement de la taille de l’adipocyte) en plus de l’hyperplasie (augmentation de nombre d’adipocytes), une distinction qui est d’une importance considérable dans la recherche sur l’obésité, où l’hypertrophie est fortement liée à la dysfonction adipeuse chez les personnes obèses21. L’épidémie d’obésité, ont suscité beaucoup d’intérêt dans l’identification des médicaments capables de contrôler le stockage des lipides. Ce dosage FABP4 fournit également une lecture simple pour le dépistage des milliers de composés pour leur capacité à inhiber l’accumulation de lipides.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants envers les bailleurs de fonds des tissus adipeux et les professionnels de la recherche qui collectent et nous fournissent cette ressource pour la recherche. Nous tenons à remercier financement par Allergan. Nous sommes également reconnaissants à l’Université d’Auckland, Faculté de médecine et santé des fonds de recherche de Sciences de la Performance basée pour financer le coût de filmer et d’édition pour la présentation de cet article.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |