Протокол описывает простой проба для выявления Drosophila melanogaster личинки, которые испытывают гипоксии при нормальных атмосферного кислорода. Этот протокол позволяет гипоксических личинок необходимо отличать от других мутантов, которые показывают перекрывающихся фенотипов как вялость или медленный рост.
Лишение кислорода в животных может привести от воздействия низкого атмосферного кислорода или повреждения внутренних тканей, который влияет на распределение кислорода. Это также возможно, что аберрантное поведение кислорода зондирования нейронов может вызвать гипоксию подобное поведение при наличии нормальной кислорода. В D. melanogasterразвития на уровнях низкой кислорода приводит к ингибированию роста и вялый поведение личиночных стадиях. Однако эти установленные проявлений дефицита кислорода значительно пересекаются с фенотипов многие мутации, которые регулируют рост, стресс ответы или передвижения. Как результат в настоящее время не проба для выявления i) сотовых гипоксии, индуцированные мутации или ii) гипоксия подобное поведение при индуцированных ненормальное поведение нейронов.
Недавно мы определили два отличительных поведения в D. melanogaster личинки, которые происходят на нормальный кислород уровнях в ответ на внутренние обнаружения гипоксии. Во-первых на всех этапах, такие личинки избежать, прячась в пищу, часто отходит далеко от источника питания. Во-вторых туннелирование в мягкой субстрат, который обычно происходит на этапе блуждающих третьего возраста полностью отменяется при гипоксических личинки. Assay, описанные здесь предназначены для обнаружения и quantitate эти поведения и таким образом обеспечить способ выявления гипоксии, вызванные внутренние повреждения, а не низкой внешней кислорода. Пробирного пластины с агар субстрат и Центральный дрожжей пасты используются для поддержки животных через личиночной жизни. Позиции и состояния личинки отслеживаются ежедневно они перейти от первого до третьего возраста. Степени туннелирования в субстрат агар блуждающих этапе предел после Окукливание с помощью NIH ImageJ. Assay будет значение в определении, когда гипоксии является компонентом мутант фенотип и таким образом обеспечить понимание возможных мест действий в вопросе гена.
Сложный спектр молекулярных генетических инструментов, имеющихся в D. melanogaster делают его ценным организма для изучения эволюции сохранение биологических процессов. Основные молекулярные ответы на наличие кислорода доказали быть сохранены через эволюцию и предварительного исследования в D. melanogaster породили проницательности в универсальные компоненты этих сигнальные пути 1,2, 3,4,5,6.
В рамках исследования, направленные на разбор функции сенсорного нейрона в D. melanogaster личинки мы определили два поведенческих реакций, которые оказались активироваться тканевой гипоксии в нормальной кислорода уровнях 7. Один из них, неспособность зарываются в пищу, очень связано с ответ на низкой кислорода, сообщает Wingrove и O’Farrell 8. Второй поведение, неспособность туннель в мягкое субстрата в конце третьего instar блуждающих фазы, не были определены ранее как связанные с гипоксией. Мы определили, что разоблачение блуждающих личинки дикого типа с низким содержанием кислорода уровнях также ингибирует субстрат, туннелирование 7, таким образом устанавливая, что обе эти поведения происходят от гипоксии,-либо индуцированного повреждения тканей или низкое потребление кислорода. Здесь мы описываем assay которую мы разработали, чтобы quantitate эти два гипоксия индуцированного поведения, который начинается с замечания сразу же после вылупления личинок.
Гипоксический ответы на ранних личиночных стадиях не были изучены ранее и поэтому анализ всей личиночной жизни является ценным компонентом нашего анализа. Большинство очевидных проявлений гипоксии – медленное развитие, слабый рост и вялость опорно – совпадают с личинок фенотипов, производимые многие мутации. Но мы обнаружили, что только третьего возраста личинки с гипоксией Показать полный провал туннеля 7. Таким образом мы определили, что даже личинок более угрозу с точки зрения роста и передвижения чем наши гипоксических личинки, все еще осуществляется туннелирование, тогда как гипоксическая личинки никогда не туннель 7. Таким образом, еще одним ценным элементом этот assay является, что она предоставляет способ установить при гипоксии является источником определенного набора плейотропный фенотипы, в отличие от некоторых других стресс или метаболических неисправности. Как проявление assay, здесь мы опишем его использования при характеристике ответы личинки с сокращением трахеи выражением uninflatable, ген, который функционирует в личиночной airways 9.
Мы предполагаем, что этот assay будет иметь ценность для исследователей, занимающихся характеризующие личиночной фенотипов, которые включают медленный рост и вялый поведение. В результате, новые гены, которые влияют на распространение, использование или ответы, могут быть определены кислород по всему телу. Кроме того включение этот assay в мутанта скрининг протокол обеспечит прямой маршрут для выявления мутаций, которые производят гипоксии. Этот assay также будет ценным в анализе схема, которая вызывает гипоксия индуцированной врожденное поведение, описанных здесь. Анализ нейронной сети этого типа является фокус много текущих исследований и простой нервной системы D. melanogaster личинка является ценным системы для рассечения из автоматического поведения. Уже были определены Сенсорные нейроны участвуют в восприятии личиночной кислорода, обеспечивая первый шаг на пути определения полной схемы для гипоксия индуцированной ответы 10,11. С помощью нашего анализа в сочетании с выборочной нейронных нокдаун через GAL4-Уан системы12 является четкий маршрут для определения дальнейших компонентов нейронной сети.
Мы представили здесь простой пробирного, предназначенных для выявления гипоксии тканей в D. melanogaster личинки. Диагноз основывается на снижение прячась в продовольственной курганы ранних личиночных жизни и отсутствие субстрат, туннелирование в конце жизни личинок. Личинок скученность может привести к преждевременной миграции от источника питания и таким образом одним из важнейших аспектов assay что небольшое количество личинок assayed присутствии большого пищи избытке. Включение фунгицида метил p гидроксила бензоат (Nipagen) в плиты агара также важно для предотвращения плесени во время анализа.
Мы находим, что плиты агара может быть источником изменчивости в assay. Как правило личинки же генотипа, из разных партий родителей, или из различных коллекций личинок, показать сравнительно ограниченные изменения в их поведении в assay. В отличие от плиты агара на разные дни или с различных серий агар может принести различия в туннелирования. Одно условие поэтому этот элемент управления и экспериментальной личинки должны все быть протестированы с использованием плиты агара от же подготовки пакета. Агар из разных производителей или даже грузы от же производства может варьироваться в их гелеобразующего силы, и поэтому она может потребоваться регулировка концентрации агара вверх от 2,2%, здесь используется для достижения оптимального гель. Мы обнаружили, что дикого типа личинки могут легко закапываться через 3% агар гели.
Для того, чтобы продемонстрировать значение этот assay, мы использовали его для расследования возможных гипоксии тканей в личинки с подавленной функцией uninflatable в трахею. Наши выводы оказывать решительную поддержку гипотезы, что потеря трахеи экспрессия этого гена могут производить гипоксии: btl-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки показали неспособность зарываются в пищевой и полное отсутствие субстрат туннелирование во время третьего возраста. В наших предыдущих исследований других генотипов, мы наблюдали, что гипоксия индуцированной потери продовольствия роющих не как потеря субстрат туннелирования и btlполной-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки учился здесь ведут себя аналогичным образом. Неудачных туннелирования компонент этот assay поэтому обеспечивает сильные проявление гипоксии.
Хотя btl-Gal4 > uif RNAi личинки показал поведенческие черты диагностики гипоксии, Вырезать(ue)-Gal4 > UAS –ГФИ интерференции не проявляют эти ненормальности. Btl и Вырезать(ue) Gal4 драйверы выражаются на различных этапах и в различных моделей, в трахею личинки. Btl-Gal4 драйвер выражается во всей системе трахеи, начиная от ее развития в эмбриогенезе и продолжая до личинок жизни. В отличие от Gal4 выражения из Вырезать(ue)-Gal4 драйвер только начинается в конце эмбриональной жизни, после морфогенез трахею и ограничивается крайней задней секции спинной стволы, основных продольных сосудов системе трахеи. ГФИ сногсшибательно с этой линией Gal4 поэтому не может уменьшить ГФИ выражение достаточно рано или широко достаточно производить некоторые порогового уровня гипоксии, необходимые для запуска поведения измеряется в этот assay.
Предварительного исследования обнаружили, что третий instar личинки воздействию низких уровнях кислорода (10%) показывают снижение роста и задержки начала pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки учился здесь достигла третьего возраста, но влияние на темпы роста и Окукливание были более выраженными: они были значительно меньше, чем элементы управления с очень мало жировой ткани под pupariation попытка эпидермиса (рис. 3) и лишь незначительные часть (~ 10%). Эти различия свидетельствуют о btl-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки испытал большую степень гипоксии, потому что ГФИ нокдаун в трахею присутствовал на протяжении всей жизни личинок, либо потому, что она подготовила более тяжелые кислорода в третьего возраста. На данный момент неясно как потеря функции ГФИ в трахею может предотвратить транспорта кислорода. Трахею btl-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки были легко видны через кутикулу (рис. 3), указывает, что они содержатся воздуха и не были повреждены до того, что поступления флюида нарушена функция. Поэтому формально возможно что трахеи ущерб, созданные потери функции ГФИ не вызывают гипоксии, но скорее некоторые другие дефект, который подавляет туннелирования. Для генотипов, изучал ранее мы определили, что неспособность туннель ассоциируется с повышенный уровень ЛДГ мРНК7, канонические Индикатор гликолиза и гипоксии в конце третьего возраста личинок 15. Таким образом, окончательное подтверждение гипоксии для btl-Gal4 > UAS –ГФИ RNAi личинки (и в личинки, рассмотрены в будущем использовать этот assay) будет включать RT-PCR оценить уровни mRNA ЛДГ или использование коммерчески доступных индикаторов для измерения уровень внутриклеточного кислорода (например, см. 16).
The authors have nothing to disclose.
Карен м. Цян был удостоен 2016 Джорджа Дж. Шрепфер исследований премии Университета Райс. Fanli Чжоу является получателем учебных стипендий из Университета Райса. Услуги центра дрозофилы фондовой Блумингтон, Гарвардский поездки фонда, Вена дрозофилы ресурсный центр с благодарностью.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |