全场光学相干显微镜，用于角膜移植物基质特征的组织学样分析

这里描述的所有方法都是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的，并遵循人体组织的国际道德要求。这是一项前瞻性观察性病例对照研究。获得患者的知情同意。没有对法国的治疗或随访标准进行修改。机构审查委员会（IRB）获得了患者保护委员会的批准，Ile-de-France V（14944）。 1. 组织选择和制备 选择供体角膜。 在FF-OCM成像28之前，将储存在器官培养基26中的供体角膜转移到补充葡聚糖的器官培养基中3天，以允许膨胀27（参见材料表）。 准备样品。 将角膜浸入储存介质中，放在样品架中，上皮朝上。 将干净的二氧化硅盖玻片（随样品架一起提供）放在角膜顶部，并通过轻轻转动其底座来关闭支架，直到样品稍微变平并固定在盖玻片下方，从而提供相对均匀的成像表面。采取预防措施以避免任何气泡。 在盖玻片上涂上一层厚厚的眼科或光学凝胶作为浸没介质。 2. FF-OCM初始化、设置和图像采集 初始化设备。 通过操作设备背面的电源开关打开设备;设备正面的绿色 LED 亮起表示电源已打开。 通过操作前面的电源开关打开专用计算机和卤素光源。 双击桌面快捷方式启动采集软件（参见 材料表）。 确保成像载物台畅通无阻，但可移动托盘除外。然后单击“确定”以在提示符下初始化电机。 拉出托盘并将样品架插入专用容器中，然后轻轻推回托盘。 设置设备。 在指定和必填字段中输入“样本标识符”;可选择输入“样品描述”和/或“研究描述”。 准备好后单击“获取微距图像”，以创建样品的快照，以便以后用于横向定位和导航目的;满意后，在提示符下单击“是”验证图像，然后设备将样品盘移动到物镜下方并执行自动调整。 在继续操作之前，请确保显微镜物镜充分浸入光学凝胶中。 获取堆栈。 选择“探索”选项卡以准备收购。 在获取一堆图像之前，通过操纵杆的平移或在屏幕上手动选择（即，通过单击并将采集的宏观图像上的红色方块拖动到所需位置）导航到角膜中心。 通过旋转操纵杆、调整滑块或在图形用户界面 （GUI） 中手动输入键盘来改变成像深度，并调整平均值（通常建议平均值为 40 以获得最佳角膜成像）。注意：这样做是为了确定角膜样本的厚度以及在整个角膜厚度上成像所需的平均值，同时深入记录第一个和最后一个图像位置。盖玻片的底面产生平行的干涉条纹，在断层扫描图像（GUI的右侧）上可以看到，这有助于定位角膜表面。 在“深度”字段中输入角膜表面值或深度的第一个图像位置。 选择“获取选项卡”以获取图像。 选择“切片间距”（默认和推荐设置为 1 μm，与设备的轴向分辨率相匹配），然后在“切片数”下相应地输入角膜厚度值。 查看参数和采集时间，满意后按“确定”启动采集。 在采集过程中，避免与 FF-OCM 所在的工作台接触。 3. 采集图像的管理 查看和导出图像。 双击桌面快捷方式启动FF-OCM查看软件（见 材料表）;采集的图像（由样品ID标识）显示在“局部研究”列表中。 选择具有相应样本ID的研究，其中包含宏图像和采集的图像堆栈，并通过右键单击一系列图像并选择“DICOM”格式来“导出”后者，以保留原始像素数据和元数据以供进一步分析。 通过双击一系列图像，使用多平面重建 （MPR） 模式在 面 和横截面视图中显示 3D 图像堆栈;浏览图像（例如，通过鼠标滚轮滚动或滑块调整）并选择每个堆栈的代表性 EN 面 和横截面视图。 使用“DICOM”格式，通过单击窗口右下角的图标导出所选视图。 导入图像。 双击桌面快捷方式打开图像处理软件（见 材料表），然后导航到“插件”下的“生物格式”“导入器”以导入DICOM图像;确保在“生物格式导入选项”窗口中选择了“具有相似名称的组文件”。 4. 图像分析：基质形态和特征的定性和定量评估 评估基质和鲍曼层厚度。 手动测量角膜横截面的距离，例如横截面25 上的五个等间距点。在已知距离的两个点之间画一条线（例如，从整个图像的左到右，即根据默认视场，1，024像素或780μm），转到“分析”并选择“设置比例”，然后在相应的字段中输入“已知距离”和“长度单位”并单击“确定”。 在两个未知距离的点之间画一条线;直接从状态栏读取测量的长度或距离。 记录均值和变异系数 （COV）。Bowman的层厚度小于6.5μm和COV大于18.6%与角膜基质异常有关25。 确定角质细胞密度。 遵循共聚焦显微镜的惯例：以7为一组将基质 和面部 图像相加，以产生厚度相当的切片。为此，请转到“图像”选项卡，然后在“堆栈”下选择“重新切片Z”。 考虑到通过基质24，25的进展时不同（减少）的细胞密度。为此，根据深度，基质可以被认为是由4个区域组成的：（1）鲍曼层以下的最前基质，即整个基质厚度的2%;剩余的基质（即整个基质厚度的98%）具有三个相同厚度的区域：（2）前基质，（3）中基质和（4）后基质。 为了进一步分析，包括 所有可用的前 基质切片，前基质的15张图像，中基质的5张图像，以及后基质的5张图像（其中每个区域所需的可靠计数的图像数量通过逐步分析确定29）。 在每个 面部 图像上，选择一个 300 μm x 300 μm 的感兴趣区域。要增强细胞核可视化，请使用“编辑”选项卡下的“反转”反转图像，并调整对比度和亮度。对于后者，请转到“图像”并导航到“分析”下的“亮度/对比度”。 手动计数细胞核，例如使用“细胞计数器”功能25。为此，请转到“插件”并导航到“分析”下的“单元格计数器”。按“初始化”，然后选择计数器类型。然后通过单击倒置图像中的深色椭圆形特征开始计数细胞核，考虑那些仅针对图像25 的四个边中的两个落在图像边框上的细胞核。 按照共聚焦显微镜惯例记录以面积密度表示的细胞密度，即细胞/mm²（将计数的细胞数除以 0.09，以从细胞/90，000 μm² 转换为细胞/mm²），其中已显示患者（例如圆锥角膜）的角质细胞密度低于健康受试者，并且与疾病严重程度25 相关。注意：需要进一步的临床研究来确定是否需要角质细胞密度的最小阈值才能在移植后获得完全清晰的角膜移植物。 评估基质反射率。 生成基质图像堆栈的平均强度深度剖面，例如使用“Z轴剖面”功能和/或自定义软件25，30，31。注意：这些实际上是振幅深度剖面，因为FF-OCM测量的是样品反向散射的光的振幅，而不是其强度。计算每个 面 堆栈的平均灰度。 减去最小灰度值并按最大灰度值归一化。 在对数刻度中显示为基质深度（基质厚度的百分比）的函数。 通过线性回归线近似生成的对数轮廓，该线最小化残差平方和（最小二乘拟合）。 记录 R 平方值 （R²） 作为线性度的度量。低于 0.94 的值可能表明角膜病变25.注意：为了区分线性对数回归模型（或单指数衰减模型）由于病理的存在而不足之处，而不仅仅是测量噪声，可以通过贝叶斯推理进行信号分析31。此外，在具有线性对数（或单指数）基质深度剖面的角膜中（例如，由R平方值30或Birge比率31接近1表示），根据信号衰减率计算光子平均无路径可用于进一步量化透明度31。 评估其他基质特征和疾病指标的可见性。 检查是否存在疤痕、纤维化组织、湖泊或 Vogt 条纹。 评估基质中神经的平均厚度，如果足以进行测量24。选择一个基质神经最明显的 面部图像（ 通常在基质中部区域）。 测量神经的厚度，例如在五个点24处，然后计算平均值和标准偏差。神经厚度高于9μm可能是病理学的附加指标，例如圆锥角膜24。