Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse^1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants⁵, mis en cage-photo^6,7,8,9 et photo-commutable acides aminés^{10, 11}, acides aminés portant tendues alcènes et alcynes pour bioorthogonal sans catalyseur chimie^{2,12,13,14,15,16 ,},¹⁷acides aminés transportant dansyl¹⁸, coumarine^9,19et fluorophores²¹ prodan^20,et acides aminés équipés d’autres sondes biophysiques comme Bien que le post traductionnelle modifications^{1,2,3,4,22,23,24,25}.

Le codage génétique d’un ncAA est activé par un dédié amino-acyl–synthétase de tRNA (RAA) couplé à un suppresseur-tRNA apparenté, qui incorpore la ncAA en réponse à un codon stop ambre pendant la synthèse ribosomique ordinaire. paires de ncAARS/ARNt sont conçus afin d’être orthogonal dans l’organisme hôte, c’est-à-dire pas la diaphonie avec les paires endogènes. La technique est bien établie en hôtes procaryotes et eucaryotes et cellules facilement applicables aux mammifères. Paires pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères reposent sur trois principaux systèmes orthogonaux : le système de tyrosyl, qui combine la TyrRS d’e. coli²⁶ avec un suppresseur de tyrosyl ambre de b. stearothermophilus²⁷ (Ec TyrRS / paire YamBst), l’e. coli leucyl système (EcLeuRS/ARNt^Leu_CUA paire)^6,18,28 et le système de pyrrolysyl d’archaea (PylRS/ARNt ^Pyl paire)³, auquel cas l’ARNt^Pyl est un suppresseur de l’ambre naturel. En général, chaque ncAA est reconnu par un ncAARS spécialisées. Selon la structure de la ncAA, le ncAARS est obtenu par évolution dirigée de la TyrRS, LeuRS ou PylRS, bien que certains synthétases peuvent accepter plusieurs ncAA.

La paire orthogonale est importée dans les cellules en utilisant simplement un vecteur plasmidique. Plus efficaces et communes de plasmides sont bicistronique et codent pour la synthétase et l’ARNt formant la paire orthogonale²⁹. Un deuxième plasmide codant pour la protéine d’intérêt portant un codon ambre sur le site désigné pour la modification est co-transfectée. La ncAA est simplement ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, différents groupes spécialisés utilisent souvent les différentes variantes de constructions de plasmide même pour l’incorporation de la ncAA même. Constructions diffèrent par l’arrangement des gènes dans le vecteur, le type de la synthétase, l’utilisation de codon dans le gène de la synthétase, l’utilisation de promoteur, la variante de l’ARNt et le nombre de cassettes d’expression ARNt. En outre, l’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut varier considérablement en raison de l’efficacité catalytique différente les synthétases différentes, la qualité de l’ARNt et autres facteurs³⁰. Par conséquent, il est important de disposer d’une méthode rapide et fiable pour évaluer l’efficacité d’une paire orthogonale, à choisir le système le plus approprié pour une application souhaitée tant pour effectuer certaines étapes d’optimisation qui améliorent l’expression protéique globale rendements.

Nous avons établi une analyse axée sur la fluorescence simple et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales²⁹ (Figure 1). Dans l’essai, les cellules sont transfectées conjointement avec le plasmide codant pour la paire orthogonale, ainsi que d’un plasmide de journaliste bicistronique codant pour la protéine fluorescente verte portant un codon d’arrêt ambre à une position permissive (EGFP^TAG) et la gène mCherry. Fluorescence rouge et verte de lysats de cellules entières sont interprétées dans des canaux séparés sur un lecteur dans une plaque à 96 puits. L’intensité de la fluorescence verte est directement en corrélation avec l’efficacité de la répression ambre, alors que l’intensité de la fluorescence rouge donne une estimation directe de la taille de l’échantillon mesuré et l’efficacité de transfection. En ce qui concerne des études similaires basées sur la fluorescence assistée cellule triant (FACS) lecture^31,32, le test donne une évaluation immédiate et complète de l’expression protéique dans la population de cellules entières, ce qui est plus représentatives des conditions expérimentales usuelles et propose une acquisition de données plus facile et le traitement avec le logiciel standard. Dans l’ensemble, le principal avantage du dosage est qu’un support pour un grand nombre d’échantillons peut être analysé en parallèle. À l’aide de ce test, nous avons projeté une bibliothèque conçue rationnellement des ARNt-suppresseur pour améliorer l’efficacité du système orthogonal Pyl³⁰. Cet ouvrage décrit le protocole expérimental pour effectuer ce test et montrent des exemples de son application, y compris l’optimisation de la paire orthogonale pour l’incorporation de la photo-réticulation ncAA p-azido-L-phénylalanine (Azi) et la comparaison des efficacité de l’incorporation de différents acides aminés (Figure 2).

Au cours des dernières années, outils de ncAA sont sont avérées très puissants pour étudier la structure et les aspects fonctionnels de la G-protéine couplée récepteurs (RCPG)^33,34,35,,du^{3637 , 38}. chez les humains, les RCPG forment une grande famille de récepteurs membranaires (800 membres) et représentent les principales cibles des médicaments thérapeutiques. Il est toujours difficile de directe caractérisation structurale des RCPG et méthodes biochimiques complémentaires sont très nécessaires pour leur enquête. Nous avons mis au point l’utilisation de photo-réticulation ANAC pour cartographier les surfaces GPCR et découvrez le ligand liant poches³⁴. Est-ce que nous en utilisant notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi, systématiquement intégrées Azi dans tout le domaine de juxtamembrane entier d’un RCPG directement dans les cellules de mammifères vivants. Lors de l’irradiation UV, Azi forme une espèce de nitrène fortement réactif qui capte par covalence molécules voisines. Quand le ligand est ajouté au système, Azi sert une sonde de proximité à révéler quels postes du récepteur se rapprochent du ligand lié. De cette façon, le mode de liaison de l’hormone de neuropeptide urocortine I (Ucn1) sur le récepteur de la classe B GPCR corticotropin-releasing-factor de type 1 (CRF1R)³³ a d’abord été dévoilé. Dernièrement, nous avons divulgué modes de liaison distincte des agonistes et antagonistes sur les mêmes récepteurs³⁸. Une approche similaire a été appliquée par les autres pour révéler des orthosteric et des sites de liaison allostérique d’autres peptides et des ligands de petites molécules autres RCPG^39,40,41,42. Ce manuscrit décrit le protocole expérimental appliqué dans notre laboratoire photo-réticulation cartographie des surfaces des RCPG. La méthode est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’aucun équipement spécial, afin qu’elle s’applique dans les laboratoires de biochimie standard. Ce qui est important, l’approche fournit un outil précieux non seulement pour identifier les sites de liaison de ligand où les données structurales 3D sont rares, mais aussi pour compléter les données in vitro existantes avec les informations de récepteurs entièrement post-traductionnellement modifiées dans le environnement physiologique de la cellule en direct.

Le développement récent de nouveaux ANAC portant sur les côté chaîne des groupes chimiques convenant ultra-rapide sans catalyseur bioorthogonal chimie a ouvert la possibilité d’installer des fluorophores de dernière génération pour l’imagerie de Super-résolution en protéines directement sur la vie des cellules de^2,43. Ces ancrages chimiques comprennent tendue cyclooctyne SCOK¹⁴, nonyne bicyclo [6.1.0] BCNK^12,17et trans-cyclooctènes de TCO * K^13,15,17 entre autres ANAC héberger un norbornène^16,17,44 ou le cyclopropène^45,46 portion. ANAC encombrants pour la chimie de bioorthogonal est intégrées par une variante de le PylRS généralement décrit comme PylRS^AF (indiquant la mutation Y271A et Y349F en PylRS de M. barkeri ), ainsi que par d’autres ad hoc a évolué de ncAARSs^{17 , 44}. les ancres bioorthogonal réagissent avec tetrazine réactifs⁴⁷ par cycloaddition de Diels-Alder inverse électron-demande pour donner des rendements élevés et étiquetage dans quelques minutes^43,48. Cependant, application de cette approche puissante pour étiquette RCPG a été difficile en raison d’une faible efficacité globale du système orthogonal ncAA incorporation. En utilisant notre système amélioré de Pyl, nous avons récemment démontré incorporation de haut rendement de ces acides aminés dans les RCPG et ultrarapide GPCR étiquetage sur la surface des cellules de mammifères vivants³⁰. Récepteurs marqués étaient encore fonctionnels, car ils physiologiquement intériorisé dès l’activation du récepteur avec un agoniste. Le protocole expérimental pour l’incorporation de bioorthogonal ancres dans les RCPG et les étapes suivantes d’étiquetage sont décrites ici. Équiper les RCPG avec des fluorophores lumineux petits est la première étape fondamentale vers l’étude de la dynamique des structures RCPG dans les cellules vivantes par l’intermédiaire de techniques de microscopie avancées.