Summary

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

في هذا البروتوكول، التي تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس داخل الخلايا Sf9 باكولوفيروس وتضخيمه في ثقافة خالية من المصل تعليق. المادة طافية تنقيته من الهيبارين التقارب اللوني ويتركز المزيد من تنبيذ فائق. هذا البروتوكول مفيد لإنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج بالجينات.

Abstract

وقد استخدمت تقليديا باكولوفيروس لإنتاج البروتين المؤتلف واللقاحات. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، باكولوفيروس تبرز كوسيلة واعدة لتطبيق العلاج بالجينات. هنا، هو باكولوفيروس تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس الحمض النووي (باكميد) في ثقافة ملتصقة من الخلايا Sf9. بعد ذلك يتم توسيع باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة خالية من المصل تعليق حتى يتم الحصول على وحدة التخزين المطلوبة. ثم أنه هو تنقيته من ثقافة طافية استخدام الهيبارين التقارب اللوني. فيروس طافية يتم تحميلها على العمود الهيبارين الذي يربط جزيئات باكولوفيروس في المادة طافية بسبب تقارب الهيبارين لتغليف باكولوفيروس بروتين سكري. العمود يتم غسلها مع مخزن مؤقت لإزالة الملوثات وهو الوتيد باكولوفيروس من العمود مع عازلة عالية-الملح. هو تضعف النذرة إلى بتركيز ملح متساوي التوتر وجسيمات باكولوفيروس زيادة تركيز استخدام تنبيذ فائق. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن أن تتركز تصل إلى 500-fold مع انتعاش 25% من الجزيئات المعدية باكولوفيروس. على الرغم من أن البروتوكول هو موضح هنا يدل على الإنتاج وتنقية باكولوفيروس من الثقافات ما يصل إلى 1 لتر، الأسلوب يمكن أن تكون زيادة في ثقافة تعليق نظام مغلق لإنتاج ناقل السريرية الصف لتطبيق العلاج بالجينات.

Introduction

باكولوفيروس يستخدم في المقام الأول لإنتاج البروتينات المؤتلف واللقاحات في ليبيدوبتيران فوجيبيردا سبودوبتيرا (Sf) 9 خلايا الحشرات باستخدام المؤتلف كاليفورنية أوتوجرافا مولتيكابسيد بوليهيدروسيس النووية الفيروسات (أكمنبف) 1 , 2 , 3 , 4. في الآونة الأخيرة، فإنه يبرز بوصفه وسيلة واعدة ل تطبيق العلاج الجيني5. من المعروف أن لديها انتحاء المضيف والأنسجة واسعة ويصيب كل هادئة وتكاثر الخلايا، هي غير ممرضة، وعدم الاندماج في المضيف كروموسوم4،،من56. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج باكولوفيروس في ثقافة خالية من المصل تعليق التي هي قابلة للتطوير، ويسمح لنظام مغلق التجهيز لإنتاج السريرية في المستقبل1.

النقاء للجسيمات باكولوفيروس أمر مهم لتحقيق توصيل فعالة مع التقليل من سيتوتوكسيسيتي7،،من89. يمكن أن تتركز باكولوفيروس تنبيذ فائق أو تدفق عرضية الترشيح (النموذجي) مع تأثير محدود على العدوى به. ومع ذلك، هذه الإجراءات ليس فقط تركيز جزيئات الفيروس ولكن أيضا الحطام الخلوية والبروتينات من Sf9 الثقافة والتي يمكن أن تكون سامة في المختبر (ملاحظة شخصية) وقد حمل التهاب أو استجابة مناعية عند استخدامها في فيفو. لتجنب هذا، خاصة عند استخدام عالية تتركز مخزونات الفيروس، يلزم باكولوفيروس المعدية تنقية وفصلها عن تلويث الجسيمات.

وأبلغ العديد من الأساليب لتنقية وتركيز باكولوفيروس ناقلات10،،من1112. النهج المتاحة، يسمح الهيبارين التقارب اللوني لمستوى عال خطوة واحدة لتنقية بتركيز منخفض من تلويث البروتينات12. الأسلوب الذي يستند إلى تحديد كبريتات heparan مستقبلات باكولوفيروس13،14. بعد تحميل المادة Sf9 خلية طافية على العمود والملزم باكولوفيروس، يمكن غسلها العمود مع المخزن المؤقت (متساوي التوتر) الفسيولوجية لإزالة الجسيمات تلويث فضفاضة منضم أو غير منضم. نظراً للربط إلى الهيبارين عكسها، يمكن التيد جسيمات باكولوفيروس مع المخزن مؤقت ملح عالية، التي تضعف فورا إلى تركيز الملح (متساوي التوتر) الفسيولوجية لمنع المنظمة من صدمة ناضح12. وعلاوة على ذلك، إنتاج باكولوفيروس، فضلا عن القبض على وشطف من العمود اللوني، يمكن أن يؤديها باستخدام عملية النظام المغلق الذي يتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب).

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتصنيع وتنقية، وتركيز باكولوفيروس المعدية باستخدام الفصل اللوني لتقارب والطرد المركزي. باختصار، نحن إنتاج باكولوفيروس من تعداء الخلايا Sf9 مع باكولوفيروس بلازميد الحمض النووي في الثقافة ملتصقة وتوسيع باكولوفيروس المعدية في ثقافة خالية من المصل تعليق. ونحن نق باكولوفيروس استخدام الهيبارين التقارب اللوني واستخدام تنبيذ فائق كخطوة أخيرة عالية التركيز متجه لتطبيق العلاج بالجينات.

Protocol

انظر الشكل 1 لمثال على تلخيص البروتوكول. 1-تنقية باكولوفيروس بلازميد الحمض النووي تنمو ثقافة البكتيرية التي تحتوي على باكولوفيرال بلازميد الحمض النووي (باكميد)14 في 200 مل مرق LB مع المضادات الحيوية؛ كاناميسين (50 ميكروغرام/مل)، التتراسيكلين (10…

Representative Results

البروتوكول قدم في رسم تخطيطي تدفق (الشكل 1). وتشمل الخطوات عابر تعداء الخلايا Sf9 مع باكميد الحمض النووي لإنتاج باكولوفيروس في الثقافة ملتصقة في صفيحة، التضخيم اللاحقة في الثقافة تعليق خالية من المصل، العلاج نوكلاس والتوضيح بالطرد المركزي والترشيح، والتن?…

Discussion

ويصف البروتوكول المعروضة هنا إنتاج باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة الوقف، وتنقية باكولوفيروس الهيبارين تقارب لوني باستخدام. المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول تعظيم العائد وتقليل المنظمة باكولوفيروس المعدية. يظهر هنا وينص البروتوكول تحقيق انتعاش تحسنت بشكل ملحوظ للجسيمات باكولوف…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل هو تدعمها جزئيا من مؤسسة البحوث (الرشيد سينسيناتي للأطفال) التمويل الأولى لرائد ومنحة أساسية مبتكرة (ICG) يدعمه المركز الوطني “النهوض بالعلوم متعدية الجنسيات” من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم UL1 TR001425. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

References

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).

Play Video

Cite This Article
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

View Video