Summary

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

Published: December 22, 2017
doi:

Summary

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Abstract

La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, manteniendo una barrera mecánica al mundo exterior. Además, queratinocitos juegan un papel esencial en la iniciación, mantenimiento y regulación de la respuesta inmune epidérmica por ser parte del sistema inmune innato responde a los estímulos antigénicos de una manera rápida y no específica. Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta y demostrar que estas células responden a la diferenciación terminal inducida por calcio, medida por un aumento de expresión de la diferenciación marcador involucrin. Además, mostramos que los queratinocitos aislados responden a la activación de vías de señalización intracelular inducida por IL-1β como es medido por la activación de la vía de p38 MAPK. Tomados en conjunto, se describe un método para el aislamiento y cultivo de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta. Porque los queratinocitos son el tipo celular predominante en la epidermis, este método es útil para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea in vitro.

Introduction

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y sirve como una barrera protectora contra el medio ambiente externo. La piel se compone de dos capas principales: la dermis y la epidermis, donde la epidermis constituye la capa más externa de la piel. El tipo de célula más abundante en la epidermis es keratinocytes que comprende más del 95% de la masa1,de célula2. Los queratinocitos se mantienen en distintas etapas de diferenciación de la epidermis y se organizan en estratos basals, espinosas, granuloso y cornified que corresponden a etapas específicas de diferenciación3. La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, produciendo una barrera intacta al mundo exterior.

Los queratinocitos también representan la primera línea de defensa contra patógenos en la piel y por lo tanto juegan un papel importante en la respuesta inmune innata4,5. Exposición de los queratinocitos a los estímulos externos conduce a la activación de vías de señalización intracelular y posteriormente, producción de un número de varios mediadores inflamatorios como citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos. Estas proteínas derivados de queratinocitos participan en la respuesta inflamatoria por reclutar y activar las células inmunes tales como células dendríticas, neutrófilos y específicos6,de las células de T7. Así, porque los queratinocitos desempeñan un papel crucial en numerosos procesos biológicos, el fundamento de la técnica presentada aquí fue generar un modelo en vitro para estudiar la biología de la piel. Cultivos de queratinocitos primarios obtenidos de prepucio neonatal se utilizan a menudo para estudiar la piel biología8,9. Sin embargo, con la técnica descrita aquí, queratinocitos de ambos sexos se obtienen dando por resultado una mayor diversidad biológica de las células.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento y la generación de keratinocytes humanos primarios de piel de adultos, incluyendo el mantenimiento y la congelación de los queratinocitos. El objetivo general de este método es generar keratinocytes humanos primarios que pueden utilizarse como modelo para estudiar biología cutánea in vitro.

Protocol

La recogida de muestras de piel de voluntarios sanos adultos sometidos a cirugía plástica requiere la aprobación del Comité de ética en las instituciones de acogida. Este protocolo fue aprobado por la Regional ética Comité de región Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). El método aquí descrito se deriva de estudios similares por Maciaq et al. 10 y11del Liu y Karasek. 1. aislamiento de queratinocitos de la piel humana <li…

Representative Results

Diferenciación Terminal inducida por calcioKeratinocytes humanos experimentan diferenciación terminal sobre el tratamiento con calcio14,15,16. Queratinocitos humanos primarios fueron aisladas y cultivadas como se describe en el protocolo anterior. Cuando aproximadamente 50-60% de confluencia, las células fueron estimuladas con calcio (1,2 mM) o vehículo y fotografías de las células fueron tomadas en el…

Discussion

Aquí, describimos cómo fácilmente aislar queratinocitos humano primario de piel adulto y su cultivo en vitro. Este modelo puede tener un amplio uso para la investigación de Biología de la célula epidérmica y puede ser útil para los investigadores interesados en el estudio de enfermedades cutáneas.

Algunas de las ventajas del protocolo descrito aquí es que en contraste con queratinocitos de prepucio neonatal de los varones recién nacidos sometidos a la circuncisión, keratin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El autor desea agradecer a Annette Blak Rasmussen y Kristine Moeller por su soporte técnico

Materials

KSFM ThermoFisher Scientific 17005-034 Cell culture medium
KSFM supplements ThermoFisher Scientific 37000-015 Supplements for KSFM
DPBS ThermoFisher Scientific 14190-144 DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Dimethyl sulfoxid
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15710-049 Cell culture medium additive
Sterilization filter Sartorius 16534 Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin Sigma-Aldrich T7409 Used to trypsinize cells
Glucose Sigma-Aldrich G7528
RPMI-1640 ThermoFisher Scientific 61870-010
FBS ThermoFisher Scientific 16000044 Used to inactivate trypsin
Forceps Forceps from any company can be used
Scissors Scissors from any company can be used
Scalpel Swann Morton 0501 Scalpels from any company can be used
70% ethanol
Gauze pads NOBAMED 875420 Gauze pads from any provider can be used
Foot planer Credo Solingen 1510 Foot planer from any provider can be used
Petri dishes TPP 93100 Petri dishes from any provider can be used
Metal filter In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks NUNC 156499
150 cm2 culture flasks TTP 90151
0.05% Trypsin-EDTA solution ThermoFisher Scientific 25300-062 Used to trypsinize cells when passaging

References

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Cite This Article
Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (130), e56863, doi:10.3791/56863 (2017).

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