CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie
Summary
Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système fournit un outil prometteur pour le génie génétique et ouvre la possibilité d’une intégration ciblée des transgènes. Nous décrivons une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-basé de stratégie pour ADN efficace visant l’intégration en vivo et ciblé des thérapies géniques en utilisant CRISPR/Cas9.
Abstract
Comme une plateforme de montage prometteurs du génome, le système CRISPR/Cas9 a un grand potentiel pour des manipulations génétiques efficace, surtout pour l’intégration ciblée des transgènes. Cependant, en raison de la faible efficacité de la recombinaison (HR) et différentes mutations indel de fin non homologue rejoindre (NHEJ)-base de stratégies dans les cellules non-divisant, in vivo du génome édition reste un grand défi. Nous décrivons ici une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-CRISPR/Cas9 système d’intégration ciblées précis efficace in vivo . Dans ce système, le génome ciblé et le donateur vecteur contenant armes d’homologie (~ 800 bp) flanqué de cible de RNA (sgRNA) guide unique séquences sont clivés par CRISPR/Cas9. Cette stratégie axée sur les HMEJ réalise intégration du transgène efficace zygotes de souris, ainsi que dans les hépatocytes in vivo. En outre, une stratégie HMEJ propose une approche efficace pour la correction de la fumarylacétoacétate hydrolase (Fah) mutation dans les hépatocytes et sauve Fah-carence induite par souris d’insuffisance hépatique. Pris ensemble, en se concentrant sur ciblé intégration, cette stratégie HMEJ fournit un outil prometteur pour une variété d’applications, y compris la génération de modèles animaux génétiquement modifiés et les thérapies géniques ciblées.
Introduction
Montage précis et ciblé du génome est souvent requis pour produire des modèles animaux génétiquement modifiés et thérapies cliniques. Beaucoup s’est efforcé de développer diverses stratégies pour génome ciblé efficace, édition, comme la nucléase de doigt de zinc (ZFN), nucléases effecteur comme activateur de transcription (TAPS) et les systèmes CRISPR/Cas9. Ces stratégies de créer des cassures double brin de l’ADN (DSB) dans le génome et tirent parti des systèmes de réparation de l’ADN intrinsèques, tels que la recombinaison (HR)1,2, microhomology-mediated fin rejoindre (MMEJ)3 , 4 , 5et à la fin non homologue rejoindre (NHEJ)6,7,8 pour provoquer l’intégration ciblée des transgènes1,9. La stratégie axée sur les ressources humaines est actuellement le plus utilisé du génome édition approche, qui est très efficace dans les lignées cellulaires, mais pas facilement accessible aux non-diviser des cellules en raison de son occurrence limitée à la fin de la phase S/G2. Ainsi, la stratégie axée sur les ressources humaines n’est pas applicable pour l’édition de génome en vivo . Récemment, la stratégie axée sur la NHEJ a été développée pour le gène efficace knock-in dans la souris tissus8. Néanmoins, la méthode de NHEJ introduit généralement indels au niveau des jonctions, rendant difficile générer l’édition génome précis, surtout lorsque vous essayez de construire dans le cadre de fusion de gènes8. MMEJ l’intégration ciblée est capable de génome précis édition. Toutefois, elle n’augmente que modestement l’efficacité de l’intégration ciblée dans les précédents rapports5. Par conséquent, l’amélioration de l’intégration ciblée précise en vivo est absolument nécessaire pour des applications thérapeutiques large3.
Dans un ouvrage récemment publié, nous avons démontré une fin médiée par homologie rejoindre (HMEJ)-basé de stratégie, qui a montré la plus grande efficacité de l’intégration ciblée dans des stratégies signalés tous les deux in vitro et in vivo10. Ici, les auteurs décrivent un protocole portant création du système HMEJ, et aussi la construction des vecteurs RNA (sgRNA) single-guide ciblant le gène d’intérêt et le donateur vecteurs hébergeant sites de cibles sgRNA et ~ 800 bp d’armes homologie (Figure 1) . Dans ce protocole, nous décrivons également les étapes détaillées pour la génération de souris knock-in DNA et brèves étapes pour une intégration ciblée dans les tissus en vivo. Par ailleurs, une étude de validation de la stratégie axée sur les HMEJ a démontré sa capacité à corriger la mutation Fah et sauvetage Fah– / – foie échec souris, qui de plus a révélé son potentiel thérapeutique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes plus critiques dans la construction des plasmides de donateurs HMEJ sont : (1) sélection de la sgRNA avec la haute efficacité de clivage de l’ADN et de la faible distance entre site de coupe sgRNA et codon stop (2) bonne interprétation du donneur HMEJ. CRISPR/Cas9-mediated clivage sur les deux vecteurs de donneur transgène (contenant des sites cibles sgRNA et armes de l’homologie ~ 800 bp) et le génome ciblée est nécessaire pour l’intégration ciblée efficace et précise in vivo. Les ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par CAS priorité stratégique Research Programme (XDB02050007, XDA01010409), le National Hightech R & D Program (programme 863 ; 2015AA020307), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC accorde 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Chine programme jeunes – mille Talents (HY), Break par le biais de projet de l’Académie des Sciences de Chine, Shanghai ville Comité des sciences et techniques du projet (16JC1420202 à HY), le ministère des sciences et technologies de Chine (la plupart ; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
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