Summary

Manejo y tratamiento del hombre europeo anguilas (Anguilla anguilla) de maduración Hormonal y criopreservación de esperma

Published: January 28, 2018
doi:

Summary

Protocolos de criopreservación de maduración y esperma de anguila europea han sido mejorados en los últimos años. Este artículo describe el protocolo mejor disponible con gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir la maduración y metanol como crioprotector.

Abstract

Durante los últimos años, varios grupos de investigación han estado trabajando en el desarrollo y mejora de nuevos protocolos para el manejo de la anguila europea y la maduración. Como de sin embargo, inyecciones semanales de gonadotropina coriónica humana (hCG) han demostrado lo machos después de sólo 5-6 semanas de tratamiento, produciendo altos volúmenes de esperma de alta calidad durante varias semanas. Además, protocolos de criopreservación de espermatozoides utilizando diferentes diluyentes, crioprotectores y enfriamiento y descongelamiento veces se han descrito previamente para la anguila europea. Aquí, mostramos que Tanaka´s solución de extender puede ser utilizado directamente para la fertilización o para la criopreservación, haciendo innecesario el uso de diferentes tipos de soluciones y diluciones. Además, el uso de metanol como crioprotector hace este Protocolo fácil de usar como metanol tiene baja toxicidad y no activa el esperma. El esperma no necesita ser congelados inmediatamente después de la adición del crioprotector, y puede ser utilizado durante mucho tiempo después de ser descongelado. Por otra parte, la motilidad del esperma sigue siendo alta después de descongelar, aunque es menor que la del semen fresco. El objetivo de este trabajo es mostrar el mejor protocolo disponible para la anguila europea, manipulación, maduración y criopreservación de esperma.

Introduction

En los últimos 25 años, el número de anguila europea (Anguilla anguilla) al llegar a la Costa Europea ha disminuido constantemente en 90% 1,2,3. Hay varios factores que explican esta caída drástica como contaminación, infecciones, sobrepesca y fragmentación del hábitat. Todo esto ha tenido un profundo efecto sobre esta especie, conduce a la inclusión de la anguila europea en la Unión Internacional para la lista de conservación de la naturaleza (UICN) en peligro de extinción crítico 4. En consecuencia, el desarrollo de técnicas y protocolos para la reproducción en cautiverio es necesario.

La maduración de la anguila europea en cautividad se consigue por tratamiento hormonal 5,6,7 pero la producción de gametos en ambos sexos es difícil sincronizar 8. Aunque el desarrollo de nuevos implantes de andrógenos ha demostrado acelerar la Oogénesis en anguilas 9,10, el tiempo de maduración final en las mujeres es altamente variable y difícil de controlar 11. Por lo tanto, almacenamiento a corto plazo de esperma 12,13,14 y criopreservación de las técnicas son necesarias para la gestión de la reproducción, haciendo innecesario de sincronización de gametos 8.

Criopreservación de espermatozoides de la anguila europea ha sido desarrollada desde 2003 15,16. Varios investigadores diseñaron protocolos exitosos utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) o metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Aunque ambos protocolos se han utilizado con éxito, la viabilidad de las células obtenidas de semen descongelado congelados con DMSO es menor que con metanol 20,21. Por otra parte, eel esperma se activa al contacto con el DMSO y requiere de manipulación de espermatozoides más tedioso 19, por lo tanto, el metanol es más adecuado crioprotector para que la esperma de anguila europea de DMSO.

Aquí, el protocolo para el manejo óptimo y tratamiento hormonal de la anguila europea se describirán a continuación. Además, el protocolo de criopreservación de esperma de anguila europea mejor usando metanol como crioprotector y un protocolo para la evaluación de la calidad del esperma en esta especie también se describe.

Protocol

Todos los procedimientos para trabajar con anguila europea se describe en este protocolo fueron aprobados por el Comité de ética de la experimentación Animal en la Universitat Politècnica de València, siguiendo las leyes españolas y las regulaciones que controlan los experimentos y procedimientos en animales vivos. 1. pescado mantenimiento Las anguilas europeas a un centro de investigación y poner en un acuario de 200 L con un sistema de recirculación. Utilice termostatos y r…

Representative Results

Semen de 18 morenas con una motilidad del esperma de 70% o más, fue seleccionado para este estudio. Los resultados mostraron una reducción en todos los parámetros de calidad después de deshelar en comparación con los de esperma fresca (tabla 1 y figura 2). Los resultados de motilidad (promedio ± SEM, n = 18) demostró una mayor motilidad total y una motilidad progresiva en esperma fresca que la motilidad total y motilidad progresiva enc…

Discussion

Este protocolo describe el proceso completo para la criopreservación de maduración, la manipulación y el esperma de anguila europea. Las condiciones de cría descritas aquí son óptimas para la producción de altos volúmenes de esperma de alta calidad en esta especie 6,7,25y maduración rápida. El éxito de este protocolo de criopreservación y su potencial uso para la fertilización después de descongelar dependen mucho …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicación fue financiada por la investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación del programa bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie No 642893 (IMPRESS), la oficina de costo (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) y el centro de investigación de excelencia- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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