Summary

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

De Drosophila eierstok is een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel niche ontwikkeling. Hoewel de methoden voor het ontleden van larvale en volwassen eierstokken zijn gepubliceerd, vereisen pop eierstok dissecties verschillende technieken die niet zijn gepubliceerd in detail. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor ontleden, kleuring en montage van de pop eierstokken.

Abstract

In tegenstelling tot volwassen Drosophila eierstokken, pop eierstokken zijn relatief moeilijk te openen en te onderzoeken vanwege hun kleine omvang, doorschijnendheid en impasses binnen een pop geval. De uitdaging van de ontrafeling van pop eierstokken ligt ook in hun fysieke locatie binnen de verpopping: de eierstokken zijn omringd door lichaamscellen van vet in de buik van de pop, en deze vetcellen moet worden verwijderd als u wilt toestaan voor de juiste antilichaam kleuring. Om deze uitdagingen te overwinnen, dit protocol maakt gebruik van aangepaste Pasteur pipets om vet lichaamscellen extract van de pop buik. Bovendien is een chambered dekglaasje gebruikt in plaats van een microcentrifuge buis tijdens het kleuring ter verbetering van de zichtbaarheid van de poppen. Echter, ondanks deze en andere voordelen van de instrumenten die gebruikt worden in dit protocol, succesvolle uitvoering van deze technieken nog mogelijk enkele dagen van praktijken als gevolg van de geringe omvang van pop eierstokken. De technieken die worden beschreven in dit protocol kunnen worden toegepast op tijd cursus experimenten waarin de eierstokken worden geanalyseerd in verschillende stadia van ontwikkeling van de pop.

Introduction

Stamcelonderzoek met behulp van Drosophila eierstokken heeft wijd uitgebreid sinds de eerste documentatie van een stamcel niche1,2,3,4. Volgt de ontwikkeling van Drosophila eierstok dissecties hebben zijn gebruikt bij het bestuderen van de stamcel lineages lineage tracering genetische hulpmiddelen en signalering van trajecten die stamcel onderhoud, proliferatie, en lot in de niche van de cel van de stam regelen. Kennis van deze signaalroutes kan inzicht in mogelijke oorzaken van kanker die afkomstig van de cel van de stam van de afwijkende activiteit5,6,7 zijnopleveren. Het heeft ook onlangs aangetoond dat somatische stamcellen in het ovarium van Drosophila , bekend als de cellen van de stam van de follikel (FSCs), sterk lijken op zoogdieren intestinale stamcellen in vele aspecten van hun organisatie8. Om deze reden zijn Drosophila eierstokken een zeer nuttig modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel gedrag.

Terwijl de larvale en volwassen eierstokken aanbieden aanwijzingen tot vroege ontwikkeling van de cel van de stam en de laatste cel van de stam in de niche, respectievelijk, is de pop eierstok een intermediaire structuur waarin de germline lichaamscellen reorganiseren en stellen hun identiteit 9 , 10. Hoewel verscheidene studies hebben onderzocht aspecten van weefsel ontwikkeling in de pop eierstok10,11,12,13, nog vragen met betrekking tot de differentiatie en de ruimtelijke organisatie van ovariële celtypes tijdens de ontwikkeling van de pop. In het bijzonder is de specificatie van FSCs treedt op tijdens deze periode. Dit protocol beschrijft een methode voor ontleden en kleuring pop eierstokken op gewenste tijdstippen — een techniek die gebruikt kan worden in tijd cursus experimenten die pop eierstok ontwikkeling in detail uit de larvale naar de volwassen fase analyseren.

Om de kleine grootte, doorschijnendheid en ontoegankelijkheid van de pop eierstokken in de buik van de pop te verklaren, dit protocol maakt gebruik van hulpmiddelen zoals een op maat gemaakte dun-tipped Pasteur Pipetteer om buik vet lichaamsweefsel belemmeren antilichaam toegang tot de eierstokken. Een duidelijke, chambered dekglaasje gebruikt tijdens het antilichaam kleuring biedt grotere zichtbaarheid van de poppen en een zachtere platform voor het schommelen van de eierstokken op een “Nutator.” Gebaseerd op een protocol voor het larvale eierstok ontledingen van Maimon en Gilboa14, een relatief hoge concentratie van Triton X-100 is werkzaam in de eerste stappen van de kleuring procedure te maximaliseren van de celmembraan permeabilization en antilichaam toegang tot de ovariale cellen.

Protocol

1. EggLaying Combineer ongeveer tien mannen en vijftien vrouwelijke volwassen Drosophila vliegen van het gewenste genotype in een flesje van normale rijke vliegen voedsel aangevuld met gist. Om te voorkomen dat overbevolking op de flacon, kunt u erop vrouwtjes om niet langer dan 2 – 4 h14eieren te leggen. De volwassenen van de flacon overboeken naar een nieuwe flacon door te tikken op de flacon openen tegen een ander flesje met vliegen voedsel. Laat de eieren om te o…

Representative Results

Succesvolle uitvoering van deze procedure moet leiden tot duidelijke antilichaam kleuring die de structuur en de cellulaire organisatie van een Drosophila pop eierstok onthult. Immunohistochemistry uiteengezet in dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren celtypes vaak gekleurd in larvale en volwassen eierstokken. Cellen van de pop stengel afgeleid van zwerm cellen18 (aangegeven door Fasciclin III in wit) zijn afgebeeld in Fi…

Discussion

De meest kritische en moeilijke stap van dit protocol omvat de voorbereiding van pop eierstokken voorafgaand aan de fixatie. Om ervoor te zorgen dat de eierstokken, kleine en begraven door vet lichaamscellen binnen de pop buik, voldoende zijn gekleurd met antilichamen, het is belangrijk om niet alleen een grote opening in de buik zak scheuren met een tang, maar ook het extraheren van de vet-lichaamscellen die belemmeren de de eierstokken van de antistoffen. Succesvolle uitvoering van deze stap vereist toepassing van subt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health (RO1 GM079351 aan DK). Wij danken Dorothea Godt voor haar nuttig advies over pop eierstok dissecties gebaseerd op haar oorspronkelijke protocol. Wij danken ook Amy Reilein voor haar hulp en commentaar op het manuscript.

Materials

Dumont #5 Forceps, biology Fine Scientific Tools 11252-20
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155383
Dissection microscope Nikon SMZ-10A
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Analysis software Carl Zeiss Zen
9 Depression Glass Spot Plates Pyrex 7220-85
Pasteur pipet Fisher Scientific 13-678-6B
Pasteur pipet bulb Various vendors
Bunsen burner Various vendors
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 12-544-2
22 x 22 mm glass coverslips No 1 VWR 48366-067
Dapi Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Double-sided tape Scotch
Nutator Clay Adams
Fine brush #0, #3-#5 Various vendors
Gilson Pipetman Starter Kit Thomas Scientific F167300 Contains p20, p200, p1000 pipettors
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS
Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1
10x PBS Ambion AM9624 Dilute to 1x PBS
Normal Goat Serum Jackson ImmunoResearch 5000121 Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration
Fly vials Denville Scientific V9406
Cotton Balls, For Wide Vials Genesee Scientific 51-102W
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 101400
Fly food Produced in laboratory Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) Bloomington Drosophila Stock Center

References

  1. Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
  2. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
  3. Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
  4. Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
  5. Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
  6. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  7. Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
  8. Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
  9. Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
  10. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
  11. King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
  12. Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
  13. Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
  14. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
  15. Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. 遗传学. 16 (3), 212-224 (1931).
  16. Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
  17. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  18. Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
  19. Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
  20. Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
  21. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).

Play Video

Cite This Article
Park, K. S., Godt, D., Kalderon, D. Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries. J. Vis. Exp. (133), e56779, doi:10.3791/56779 (2018).

View Video