Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum¹‘ bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca^{2 +} görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.

Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu²den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.

Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri³görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca^{2 +} görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda⁴arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca^{2 +} oldu, sağlam doku^{5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8}. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca^{2 +} görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}‘ sinyal Ca^{2 +} .

Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü’nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca^{2 +} yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal¹² açık ve nispeten genel Ca^{2 +} geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri¹³‘ te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca^{2 +}harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca^{2 +}-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs^6,14,15. Son olarak, belirli koşullar^11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca^{2 +} olaylar oluşturulabilir.

İki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca^{2 +}-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca^{2 +} dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi^17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca^{2 +}-duyarsız boya ile yeşil Ca^{2 +} göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca^{2 +}-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca^{2 +} görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca^{2 +}], [Ca^{2 +}]₀¹⁷ dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır ^{, 18}. Ayrıca, Floresans değişiklikleri^{mutlak Ca 2 +} konsantrasyonları¹⁹açısından kalibre edilmesi.

İki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca^{2 +} görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca^{2 +} dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca^{2 +} göstergeleri son derece mobil eksojen Ca^{2 +} hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca^{2 +} göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.

Biz iki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme yöntemi Ca^{2 +} dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons^{9,10,11,20,21} incelenmesi için uyarlanmış ^{, 22}. asıl nöronlarda erken Ca^{2 +} görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri²⁰ farklı olan fonksiyonel Ca^{2 +} mekanizmaları çeşitli vitrin ^{, 23 , 24}. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca^{2 +} geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca^{2 +} daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca^{2 +} dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca^{2 +} Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.

Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.