Summary

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Published: January 06, 2018
doi:

Summary

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Abstract

Kemik iliği stromal hücreler (BMSCs) teşkil Mezenkimal Kök hücre bir temsili rutin olarak kullanılan bir hücre nüfus tüp bebek. Hematopoetik kök kırmızı kan hücreleri, bağışıklık ataları ve Osteoklastlar çıkmasına neden olabilir hücre (HSCs), yanında kemik iliği kavite içinde bulundukları. Böylece, çekimi hücre popülasyonlarının sorunlar deneysel tasarım mevcut ve veri yorumu yıkmak çeşitli hücre popülasyonlarının çok heterojen karışımı içinde kemik iliği sonuçlarından biri. Birkaç yalıtım ve kültür yöntemleri laboratuvarlarda BMSCs ve HSCs invitroaz ya da homojen nüfus elde etmek için geliştirilmiştir. Burada, BMSCs ve HSCs izolasyonu fare uzun kemikler için iki yöntem mevcut: BMSCs ve HSCs karışık bir nüfusa verimleri bir yönteme ve iki hücre popülasyonlarının ayırmak için çalışır bir yöntem göre bağlılık üzerinde. Her iki yöntem hücreler için uygun sağlamak Osteojenik ve Adipojenik farklılaşma denemeleri de fonksiyonel deneyleri.

Introduction

Birincil fare BMSCs onların keşif erken 1980’lerde1beri Mezenkimal Kök hücre vitro modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Nitekim, dokusunu, Osteoklastlar, kondrosit veya adiposit birçok çalışmalar2,3, içine ayrıştırılan kapasitesi uzun kemiklerde kemik iliği boşluğundan temizlenen plastik-yapışık hücreleri kültürleri korumak 4 , 5. ancak, kemik iliği benzersiz bir doku, ancak bunlarla sınırlı olmamak, BMSCs, HSCs, endotel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere birçok farklı hücre popülasyonlarının modülüdür. Bu nedenle, yalıtım ve kültürü teknikleri farklı homojenliği ile hücre popülasyonlarının yol açabilir. Hücrelerden ayırt etme potansiyel test etmek için bu tür teknikler kullanarak zor olabilir. Örneğin, farklı genotip ile fareler hücrelerden karşılaştırırken, karma hücre nüfusuyla başlayan verilerin yorumlanması sınırlar. Tersine, BMSCs ve HSCs homojen nüfus alma ve teknik olarak zor olabilir gibi temsilcisi olmayabilir bir ex vivo modelinin.

Bizim laboratuvar biz öncelikle BMSCs kullanımı nedeniyle dokusunu, Osteoklastlar ve adiposit ayrıştırılan potansiyellerini ilgilendi. Burada, BMSCs ve HSCs yalıtım ve osteoblastogenesis veya adipogenesis vitrodeğerlendirmek için kullanılan kültür teknikleri, hem de HSCs Osteoklastlar ayırt etmek için kültürleri mevcut. Bir yöntem BMSCs ve HSCs adipogenesis, osteoblastogenesis ve osteoclastogenesis (Toplam BMCs denir) için doğrudan uygun içeren nüfus kemik iliği hücre (BMCs) kullanır. Bu yöntem bir kemik iliği microenvironment hücreleri arasında bulunan heterojenite daha yakın ex vivo gösterimidir. Başka bir yöntem bir girişim kültürü “saf” nüfus BMSCs ve HSCs (yapışık BMSCs denir) yapışık yapışık olmayan hücrelerden ayırır. Yöntemi daha sonra hücre kültürü BMSCs veya HSCs daha doğru bir sayı ile başlamak için deneyler ve kültüründe kalır diğer hücre popülasyonlarının karmaşık dolaylı etkilerinden olasılığını azaltır sağlar. Her iki yöntem daha önce yayınlanan ve farklı araştırma soruları6,7,8,9gidermek için kullanılan.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi. 1. toplama hazırlık tüpler BMSC kültür ortamı en az gerekli orta α (MEM α) ilave Fetal sığır Serum ve penisilin/streptomisin % 1’i aç. BMSC kültür ortamının 100 µL 1.5 mL microcentrifuge tüplerde yerleştirin. 3 kemik genellikle bir tek tüp hazır olun buna göre uygun olacaktır. Santrifüj tüplerde t…

Representative Results

Hücre kültürleri genel bakışİki kültürü teknikleri değerlendirme farklılaşma BMCs BMSCs ve HSCs (Toplam BMCs, şekil 1A) oluşan karışık bir nüfus veya BMSCs nüfusu HSCs (yapışık BMSCs, şekil 1B) bölünmüş izin. 48 saatlik etap iliği hücrelerinden izole edilmiştir ve kaplama (şekil 1 c) sonra onlar hızla plastik kültür plaka altına ekleyin ve bir m…

Discussion

Bu makalede, iki yöntem BMSCs kültürünün avantaj ve sınırlamaları ile sunulmaktadır. Kemik iliği geliyor hücreleri izole nispeten kolay bir işlemdir. Ancak, bir hücre nüfus Mezenkimal Kök hücre veya mediatörlerin ataları temsilci alma iliği kavite çeşitli hücresel ortamı nedeniyle zor olabilir.

Kemik iliği içeriğinin tamamını kültür içinde vivo microenvironment yakın bir gösterimini sağlar. Henüz hücreleri farelerin (genotip, tedaviler, yaş, vb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (R01 AR061164-01A1) destek verdi.

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Play Video

Cite This Article
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

View Video