Summary

استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.

Abstract

خلية الشعر الخارجي واحد من هذين النوعين من الخلايا الشعر الحسي في القوقعة الثدييات. أنها تغير طول الخلايا مع مستقبلات محتملة لتضخيم الاهتزاز ضعيف لإشارة الصوت منخفض المستوى. مورفولوجيا والخاصية الكهربية لخلايا الشعر الخارجي (أوهكس) تضع في سن مبكرة بعد الولادة. نضوج خلية الشعر الخارجي قد تسهم في تطوير النظام السمعي. ومع ذلك، عملية التنمية أوهكس لم تدرس جيدا. وهذا جزئيا بسبب صعوبة قياس وظيفتها بنهج الكهربية. هدف تطوير طريقة بسيطة لمعالجة هذه المسألة المذكورة أعلاه، هنا نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة وظيفة أوهكس في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. مع هذا الأسلوب، يمكننا تقييم cochlear الاستجابة للمحفزات نغمة نقية ودراسة مستوى التعبير ووظيفة بريستين موتور البروتين في أوهكس. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في خلايا الشعر الداخلية (إيكس).

Introduction

وظيفتين متميزتين من خلايا الشعر الحسية cochlear ضرورية لاستماع الثدييات: ميتشانويليكتريك تنبيغ (MET) واليكتروموتيليتي1،2. MET القنوات الموجودة في حزمة الشعر، إيكس (إيكس) وأوهكس تحويل الاهتزاز الصوت إلى غشاء التغييرات المحتملة، فضلا عن الإشارات الكهربائية من دوامة معصب العقدة العصبية. أوهكس تغيير طول الخلية بغشاء المحتملة وتضخيم الاهتزاز للصوت منخفض المستوى. يتم اشتقاق هذا النشاط الذي يطلق عليه اليكتروموتيليتي بريستين البروتين المحرك الموجود في الجدار الجانبي أوهكس3.

في العديد من الأنواع بما فيها القوارض، وظيفة السمع غير ناضجة في عصر ما بعد الولادة المبكرة4،5. تعذر الكشف عن لا إمكانات العمل استجابة لإشارات الصوت في القشرة السمعية قبل بداية الجلسة6،7. ودرست التنمية مورفولوجيا ووظيفة القوقعة على نطاق واسع في الماوس، وعضل، والفئران4،،من58. ميتشانوترانسدوكشن واليكتروموتيليتي من خلايا الشعر وتوضع أيضا في أوائل حقبة الحياة5.

من أجل تقييم حساسية السمع من الفئران في مختلف الإعمار ما بعد الولادة، قمنا بتطوير طريقة لاستجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) التسجيل في الجراء الفئران. تصحيح كامل الخلية المشبك عبارة عن تقنية مثالية للتحقيق في أوهكس اليكتروفيسيولوجيكالي. ومع ذلك، مقارنة مع المشبك التصحيح المنجزة في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية الأخرى، المعدل المنخفض لختم كامل الخلية محدودة التحقيق في اليكتروموتيليتي أوهكس معزولة.

هنا يصف لنا إجراء للتحقيق في أوهكس شكلياً واليكتروفيسيولوجيكالي في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التنمية الداخلية الشعر الخلية ووظيفتها.

Protocol

كافة البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على الموضوعات الحيوان بموافقة “لجنة الأخلاقيات الحيوان” “الجامعة الطبية جنوب”. 1. إعداد حلول لتجارب تحضير المخدر (انظر الجدول للمواد): 1.5% بينتوباربيتال الصوديوم المذابة في ddH2o. إعداد الحل تشريح (انظر الجدو?…

Representative Results

يمكن أثارت العبر من الفئران تخديره الجراء الأقدم من يوم الولادة 7 (P7) استخدام لهجة نقية رشقات نارية (الشكل 1A). كما هو مبين في الشكل 1 باء، الحصول على الطول الموجي العبر من الجراء الفئران أظهرت سوى ثلاث أو أربع موجات متميزة مع السعة الصغيرة. عا…

Discussion

في فئران أصغر سنا من يوم 11، يمكن ملاحظة لا إمكانات العمل استجابة للتحفيز سليمة في القشرة السمعية6،7. ولذلك، بعد الولادة يوم 11 توصف بأنها “بداية جلسة الاستماع”10. تطوير وظيفة السمع قبل بداية جلسة الاستماع لم تدرس جيدا حتى الآن. استخدام أسلوب مماثل ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل منح من برنامج 973 (2014CB943002) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (11534013, 31500841).

Materials

Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
Name Company Catalog Number Comments
Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

References

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

View Video