Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Sämlinge müssen oft auf sterile Medien angebaut werden. Dies erfordert eine vorherige Samen Sterilisation das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen auf der Oberfläche der Samen zu verhindern. Derzeit sind Arabidopsis Samen sterilisiert, mit zwei unterschiedlichen Sterilisationstechniken in Bedingungen, die unterscheiden sich leicht zwischen Labors und nicht standardisiert wurden, häufig mit dem Ergebnis nur teilweise effektive Sterilisation oder übermäßige Samen Sterblichkeit. Die meisten dieser Methoden sind auch nicht leicht skalierbar, um eine große Anzahl von Samen Linien der verschiedenen Genotypen. Technologien für Hochdurchsatz-Analyse von Arabidopsis weiterhin vermehren, werden standardisierte Techniken für die große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen Sterilisierung unerlässlich für die Durchführung derartiger Experimente immer. Die Beantwortung einer Reihe von Arabidopsis Linien zwei verschiedene Sterilisationstechniken wurde anhand des Samen Keimrate und das Niveau der Verunreinigung des Saatgutes mit Mikroben und anderen Krankheitserregern. Die Behandlungen enthalten verschiedene Konzentrationen der Sterilisierung von Agenten und Zeiten der Exposition, kombiniert, um optimale Bedingungen für Arabidopsis Samen Sterilisation zu bestimmen. Optimierte Protokolle wurden für zwei verschiedene Sterilisationsverfahren: Bleach (Flüssigkeit-Phase) und (Cl2) Chlorgas (Dampf-Phase), beide was zu hohen Keimungsraten und minimale mikrobieller Kontamination. Das Dienstprogramm dieser Protokolle wurde durch die Erprobung von Wildtyp und Mutanten Samen mit einer Reihe von Keimen Potenziale dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Samen wirksam sterilisiert werden können mit beiden Methoden ohne übermäßige Samen Mortalität, obwohl nachteilige Auswirkungen der Sterilisation für Samen mit niedriger als optimale Keimung Potenzial beobachtet wurden. Darüber hinaus wurde eine Formel entwickelt, um Forscher luftdichten Behältern in verschiedenen Größen die standardisierte Chlor Gas Sterilisationsbedingungen zuweisen können. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen einfache, effiziente und kostengünstige Samen Sterilisation für eine große Anzahl von Arabidopsis Linien.
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) ist eine erstklassige Modellorganismus für Grundlagen- und angewandte Forschung im Werk Biologie1,2,3. Während Standardbedingungen für Arabidopsis Wachstum gut etablierte4wurden, wurde die Wirkung der Samen Sterilisation auf Saatgut Lebensfähigkeit nicht rigoros getestet. Feste Medien in Platten oder Kisten werden routinemäßig verwendet, um Wachstum von Arabidopsis Sämlinge für viele experimentelle Anwendungen, wie z. B. Identifizierung von homozygot letale Mutanten in einer Trennung Bevölkerung, Beobachtung von schießen und Wurzel Phänotypen zu früh zu erleichtern Stufen, Isolierung von Pathogen-freies Gewebe, Sammlung von großen Mengen an Sämling Gewebe, Auswahl der Transformanten oder resistente Pflanzen und Bewertung der Keimung1,2,3,4 . Samen von Pflanzen in einem Gewächshaus geerntet oder Wachstum Kammer gelegentlich mit Mikroorganismen und Staub verunreinigt sind. Wachstum von Arabidopsis Sämlinge auf verschiedene Arten von sterilen Medien erfordert vorherige Samen Sterilisation, mikrobielle Verunreinigungen wie Pilze und Bakterien auf der Oberfläche der Samen zu entfernen. Die Verwendung eines wirksamen Samen Sterilisation Regimes ist entscheidend für ein ausgewogenes Verhältnis von hohen Keimung, minimale Verunreinigung und kräftiges Pflanzenwachstum.
Die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Arabidopsis Samen Sterilisation basieren auf kommerzielle Bleichmittel (Flüssigkeit-Phase) und Chlor-Gas (Dampf-Phase). Verschiedene Verfahren sind eingesetzt worden, für beide Flüssigkeit-Phase Sterilisation1,4,5,6,7,8,9 , 10 und Dampfphase Sterilisation von Arabidopsis Samen8,10,11,12,13,14,15 ,16. Während diese Verfahren wirksam bei Saatgut Sterilisation der eingesetzten Genotypen zu erreichen gewesen, wurde jedoch eine detaillierte Analyse der Auswirkungen der verschiedenen Sterilisation Behandlungen auf die Samen der verschiedenen Genotypen nicht berichtet. Daher ist die Optimierung dieser Sterilisation Verfahren erforderlich, um die Bedingungen zu definieren, in denen effiziente Sterilisation mit hohe Keimrate kombiniert wird.
The Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) ist einzigartig positioniert, um (a) Saatgut Lebensfähigkeit einer Vielzahl von unterschiedlichen Genotypen in der Sammlung und (b) nutzen Sie die Qualitätskontrollverfahren intern angewendet und als Reaktion auf Nutzer-Feedback zu testen über die Keimung der Samen. Die Ziele der hier vorgestellten Experimente waren die Auswirkungen der verschiedenen Sterilisationsverfahren auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen zu bestimmen. Optimierte Sterilisationen, die hohen Keimungsraten führen und gleichzeitig minimale Pathogenkontamination präsentieren für Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation.
Beim Anbau von Arabidopsis Samen auf sterile Medien muss irgendeine Form der Sterilisation angewendet werden. Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation-Behandlungen führen zu ähnlichen Keimen Rate und Schimmel Wachstumshemmung. Keine Sterilisation Methode bewirkt eine signifikante Reduktion Keimrate für Samen mit potenziellen hohe Keimung; Bleichmittel Sterilisation empfiehlt jedoch für Leitungen mit niedriger Keimung Potenzial (20-70 %), aufgrund der geringen, wenn auch nicht signifikant, Verbesserung der Keimrate im Vergleich zu Gassterilisation (Abbildung 3A).
Arabidopsis Samen mit Bleichmittel Konzentrationen von 40-100 % für bis zu 10 Minuten sterilisieren bietet zufriedenstellende Keimung Prozentsätze und effektive Form der Unterdrückung. Obwohl Chlorid-Konzentrationen von weniger als 40 % bieten ausreichende Sterilisation für die meisten Saatgutpartien, mit einer Konzentration von 40 % oder höher garantiert effektive Sterilisation der auch stark verschmutzte Saatgutpartien. Es ist wichtig, keine 10 min der Sterilisation überschreiten bei Chlorid-Konzentrationen gleich oder höher als 80 % hohen Mortalität und Mängel in der Sämling-Entwicklung zu vermeiden.
Behandlung von Arabidopsis Samen mit Chlor-Gas-Konzentrationen von 6,1 % oder 16,5 % für 1 h führt zu hohen Keimungsraten und angemessene Schimmel Beseitigung. Niedrige Chlor-Gas-Konzentration (2,1 %) kann erfolgreich eingesetzt werden, mit zunehmender Dauer der Sterilisation bis 3 h.
Wenn einige Zeilen werden sterilisiert müssen, wird Flüssigkeit Sterilisation in einer Lösung von 50 % Bleichmittel für 10 min empfohlen. Für eine größere Zahl von Linien ist Gassterilisation mit einer Gaskonzentration von 6,1 % für 1 h eine bessere Option, da viele Zeilen schnell und einfach mit weniger Manipulation sterilisiert werden können.
Unsere Ergebnisse liefern standardisierte Bedingungen für die Sterilisierung, große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen und die Samen mit potenziellen niedriger Keimung. Die einzige Einschränkung dieser Sterilisation-Techniken ist, dass sie auf die Samen mit Keimungsraten weniger als 20 % durch umfangreiche Samen Sterblichkeit angewendet werden können. Alternative Methoden, wie Beschallung17, Keimrate bei fehlender Sterilisation erhöhen können in diesen Fällen vorteilhaft sein.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchte Gauri Datta Danke für ihre Hilfe bei der Vorbereitung experimentelle Materialien. Wir sind auch dankbar, Bettina Wittler und James Mann für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die NSF Stipendien DBI-1049341 und MCB-1143813 unterstützt.
0.65 mL Microcentrifuge tubes | GeneMate | C-3260-5 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
1.7 mL Microcentrifuge tube | GeneMate | C-3262-1 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
7 L plastic container | Sistema | 1016265438 | Container in which gas sterilization is performed |
Concentrated HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Chemical used in the process of creating chlorine gas |
Disposable sterile inoculating loop | Fisher Scientific | 22-363-603 | Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates |
Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | Vitamin solution used in the process of making MS media |
Household bleach | Clorox | Regular-Bleach2 | Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | Chemical used in the process of making MS media |
Micropore surgical tape | 3M | 1530-1 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | Chemical used in the process of making MS media |
Parafilm M | Bemis Company | #PM996 | Parraffin film used to seal sterilization container |
Petri dish 100 X 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
pH indicator strips | Whatman | 2613991 | Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution |
Phytoagar | Fisher Scientific | 50-255-212 | Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Chemical used in the process of making MS media |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | Chemical used in the process of liquid sterilization |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | CS70000 (Col-0) | Arabidopsis wild-type seeds |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113339C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115837C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_019535C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_147597C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_209076C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081081C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107487C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2 |