El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de la esterilización con gas cloro y el cloro en la germinación de la semilla de un genotipos gama de Arabidopsis crecen en medios estériles. Se han desarrollado protocolos de esterilización optimizado para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos mientras que proporciona la supervivencia satisfactoria de la semilla.
Thaliana de Arabidopsis Plantas (Arabidopsis) a menudo deben ser cultivadas en medios estériles. Esto requiere esterilización previa de la semilla para prevenir el crecimiento de contaminantes microbianos presentes en la superficie de la semilla. Actualmente, las semillas de Arabidopsis se esterilizan utilizando dos técnicas diferentes de esterilización en condiciones que difieren ligeramente entre laboratorios y no han sido estandarizadas, a menudo resulta en la esterilización sólo parcialmente eficaz o en la mortalidad excesiva de semilla. También la mayoría de estos métodos no son fácilmente escalable a un gran número de líneas de semillas de genotipos diversos. Como tecnologías para el análisis de alto rendimiento de Arabidopsis siguen proliferando, técnicas estandarizadas para esterilizar grandes cantidades de semillas de genotipos diferentes se convierten en esenciales para llevar a cabo estos tipos de experimentos. Se evaluó la respuesta de un número de líneas de Arabidopsis a dos técnicas diferentes de esterilización basado en tasa de germinación de la semilla y el nivel de contaminación de la semilla con microbios y otros patógenos. Los tratamientos incluyeron concentraciones de esterilización agentes y tiempos de exposición, para determinar las condiciones óptimas para la esterilización de las semillas de Arabidopsis. Se han desarrollado protocolos optimizados para dos métodos de esterilización diferentes: bleach (fase líquida) y cloro (Cl2) gas (fase vapor), tanto dando como resultado tasas de germinación de semillas alta y mínima contaminación microbiana. La utilidad de estos protocolos se ilustra a través de la prueba de tipo salvaje y mutantes semillas con una gama de potenciales de germinación. Nuestros resultados muestran que las semillas efectivamente esterilizable mediante cualquier método sin la mortalidad excesiva de semilla, aunque se observaron efectos perjudiciales de la esterilización de las semillas con menor potencial de germinación óptima. Además, se desarrolló una ecuación para ayudar a los investigadores aplicar las condiciones de esterilización estándar de cloro gas en envases herméticamente cerrados de diferentes tamaños. Los protocolos descritos aquí permiten la esterilización de semillas fácil, eficiente y económico para un gran número de líneas de Arabidopsis.
Thaliana de Arabidopsis (Arabidopsis) es un organismo modelo principal para investigación básica y aplicada en planta biología1,2,3. Mientras que condiciones estándar para el crecimiento de Arabidopsis se han establecido4, el efecto de la esterilización de las semillas en la viabilidad de la semilla no ha sido rigurosamente probado. Medio sólido en placas o cajas se utiliza habitualmente para facilitar el crecimiento de plántulas de Arabidopsis para muchas aplicaciones experimentales, tales como identificación de homocigotos mutantes letales en una población segregante, observación de fenotipos de brote y raíz a principios etapas, aislamiento de tejido libre de patógeno, colección de grandes cantidades de tejido de la planta de semillero, selección de transformantes o plantas resistentes a los medicamentos y la evaluación de germinación1,2,3,4 . Las semillas cosechan de plantas cultivadas en un invernadero o cámara de crecimiento de vez en cuando están contaminados con microorganismos y polvo. Crecimiento de plántulas de Arabidopsis en diferentes tipos de medios estériles requiere esterilización previa de las semillas para eliminar contaminantes microbianos, tales como hongos y bacterias presentes en la superficie de la semilla. El uso de un régimen de esterilización efectiva semilla es esencial para un equilibrio de alta germinación, mínima contaminación y crecimiento vigoroso de las plantas.
Los dos métodos más comunes utilizados para la esterilización de las semillas de Arabidopsis se basan en lejía comercial (fase líquida) y cloro gaseoso (fase vapor). Varios procedimientos han sido empleados para ambos fase líquida esterilización1,4,5,6,7,8,9 , 10 y en la fase vapor de esterilización de Arabidopsis semillas8,10,11,12,13,14,15 ,16. Sin embargo, aunque estos procedimientos han sido eficaces para lograr la esterilización de las semillas de los genotipos utilizados, un análisis detallado del efecto de los tratamientos de esterilización diferentes sobre las semillas de diferentes genotipos no se ha divulgado. Por lo tanto, la optimización de estos procedimientos de esterilización es necesaria para definir las condiciones en que esterilización eficiente combinada con alta germinación.
La Arabidopsis biológica recursos centro (EE) es una posición única para a) prueba de viabilidad de la semilla de una variedad de diferentes genotipos en la colección y b) tomar ventaja de los procedimientos de control de calidad aplicado internamente y en respuesta a comentarios de los usuarios sobre la germinación de la semilla. Los objetivos de los experimentos aquí presentados fueron determinar los efectos de diferentes métodos de esterilización en la germinación de las semillas de los genotipos de una gama de Arabidopsis. Procedimientos de esterilización optimizado que resultan en tasas de germinación de semilla alta manteniendo la contaminación mínima del patógeno se presentan para la esterilización con gas cloro y el cloro.
Al crecer las semillas de Arabidopsis en medios estériles, debe aplicarse algún tipo de esterilización. Tratamientos de esterilización de gas cloro y cloro provocar similares germinación tasa y molde de inhibición del crecimiento. Ningún método de esterilización causa una reducción significativa en tasa de germinación para las semillas con germinación alto potencial; sin embargo, se recomienda la esterilización de lejía para las líneas con menor potencial de germinación (20-70%), debido a la pequeña, aunque no significativa, mejoría en la tasa de germinación en comparación con la esterilización con gas (Figura 3A).
Esterilización de las semillas de Arabidopsis con concentraciones de cloro de 40-100% hasta 10 min ofrece porcentajes de germinación satisfactoria y la supresión de molde eficaz. Aunque las concentraciones de cloro menos que el 40% ofrecer esterilización adecuada para la mayoría los lotes de semillas, usando una concentración de 40% o mayor garantiza esterilización eficaz de incluso los lotes de semillas fuertemente contaminadas. Es importante no superar los 10 minutos de esterilización usando blanqueador con concentraciones iguales o superiores al 80% para evitar defectos en el desarrollo de la plántula y semilla alta mortalidad.
Tratamiento de semillas de Arabidopsis con concentraciones de gas cloro de 16,5% para resultados 1 h en tasas de germinación alta y eliminación de molde adecuada o 6.1%. Concentración de gas de cloro bajo (2,1%) puede ser utilizado con éxito por aumento de la duración de la esterilización 3 h.
Cuando algunas líneas deben ser esterilizados, se recomienda esterilización líquida en una solución de lejía de 50% durante 10 minutos. Para un mayor número de líneas, la esterilización con gas con una concentración de gas de 6.1% para el 1 h es una mejor opción ya que muchas líneas se pueden esterilizar fácilmente y rápidamente con la menos manipulación.
Nuestros resultados proporcionan condiciones estandarizadas para esterilizar gran cantidad de semillas de diferentes genotipos y las semillas con germinación más baja posibles. La única limitación de estas técnicas de esterilización es que no se puede aplicar a las semillas con las tasas de germinación inferior al 20% debido a la mortalidad extensa de semillas. Métodos alternativos, como sonicación17, para aumentar la tasa de germinación en la ausencia de esterilización podrían ser beneficiosos en estos casos.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Gauri Datta por su asistencia en la preparación de materiales experimentales. También estamos agradecidos a Bettina Wittler y James Mann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la NSF becas DBI-1049341 y MCB-1143813.
0.65 mL Microcentrifuge tubes | GeneMate | C-3260-5 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
1.7 mL Microcentrifuge tube | GeneMate | C-3262-1 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
7 L plastic container | Sistema | 1016265438 | Container in which gas sterilization is performed |
Concentrated HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Chemical used in the process of creating chlorine gas |
Disposable sterile inoculating loop | Fisher Scientific | 22-363-603 | Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates |
Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | Vitamin solution used in the process of making MS media |
Household bleach | Clorox | Regular-Bleach2 | Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | Chemical used in the process of making MS media |
Micropore surgical tape | 3M | 1530-1 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | Chemical used in the process of making MS media |
Parafilm M | Bemis Company | #PM996 | Parraffin film used to seal sterilization container |
Petri dish 100 X 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
pH indicator strips | Whatman | 2613991 | Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution |
Phytoagar | Fisher Scientific | 50-255-212 | Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Chemical used in the process of making MS media |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | Chemical used in the process of liquid sterilization |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | CS70000 (Col-0) | Arabidopsis wild-type seeds |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_037606C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_041402C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_059101C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_063470C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072048C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072240C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081989C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_084124C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107354C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110111C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111322C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114702C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114872C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115657C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_116803C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113339C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115837C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_019535C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_026478C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_046565C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_143304C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_147597C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_209076C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081081C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107487C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2 |