L’objectif de cette étude était de déterminer les effets de l’eau de Javel et de chlore stérilisation au gaz sur la germination des graines d’une gamme d’Arabidopsis génotypes cultivés sur des milieux stériles. Stérilisation optimisé protocoles ont été développés pour prévenir la croissance des contaminants microbiens, tout en assurant la survie des graines satisfaisante.
Arabidopsis thaliana Semis (Arabidopsis) a souvent besoin d’être cultivées sur des milieux stériles. Cela nécessite la stérilisation des semences préalable pour prévenir la croissance des contaminants microbiens présents sur la surface de la graine. Actuellement, les graines d’Arabidopsis sont stérilisés à l’aide de deux techniques de stérilisation distinctes dans des conditions qui diffèrent légèrement entre les laboratoires et ne sont pas normalisées, entraînant souvent la stérilisation seulement partiellement efficace ou mortalité excessive de semences. La plupart de ces méthodes n’est pas facilement évolutive pour un grand nombre de lignes de semences des divers génotypes. Que technologies d’analyse de haut-débit de Arabidopsis continuent de proliférer, techniques normalisées pour la stérilisation des grandes quantités de graines de différents génotypes deviennent essentielles pour ce type d’expériences. La réponse d’un certain nombre de lignes d’Arabidopsis à deux techniques différentes de stérilisation a été évaluée à l’issu des taux de germination des graines et le niveau de contamination des semences avec les microbes et autres agents pathogènes. Les traitements comprenant différentes concentrations de stérilisation des agents et des temps d’exposition, combinés pour déterminer les conditions optimales pour la stérilisation des semences Arabidopsis. Optimisé de protocoles ont été développé pour les deux méthodes de stérilisation différents : eau de Javel (phase liquide) et le gaz de chlore (Cl2) (phase vapeur), les deux donnant lieu à un taux de germination élevé en graines et une contamination microbienne minimale. L’utilité de ces protocoles a été illustrée par l’essai de type sauvage et graines mutantes avec une gamme des potentiels de la germination. Nos résultats montrent que les graines peuvent être efficacement stérilisés en utilisant les deux méthodes sans mortalité excessive de semences, mais les effets néfastes de la stérilisation ont été observés pour les graines avec le plus bas que le potentiel de germination optimale. En outre, une équation a été développée pour permettre aux chercheurs d’appliquer les conditions de stérilisation de gaz chlore normalisés aux récipients hermétiques de différentes tailles. Les protocoles décrits ici permettent la stérilisation des semences facile, efficace et peu coûteux pour un grand nombre de lignes d’Arabidopsis.
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) est un organisme modèle privilégié pour la recherche fondamentale et appliquée en usine biologie1,2,3. Alors que des conditions normales de croissance Arabidopsis ont été bien établis4, l’effet de la stérilisation des semences sur la viabilité des graines n’a pas été rigoureusement testé. Les milieux solides dans des caisses ou des plaques sont régulièrement utilisée pour faciliter la croissance des semis d’Arabidopsis pour de nombreuses applications expérimentales, telles que l’identification des homozygotes mutants létaux dans une population en ségrégation, observation des pousses et des racines des phénotypes à tôt stades, isolement du tissu exempts de micro-organismes pathogènes, collecte de grandes quantités de tissus des plantules, sélection des transformants ou des plantes résistantes aux médicaments et l’évaluation de germination1,2,3,4 . Les graines récoltées de plantes cultivées en serre ou chambre de croissance sont parfois contaminés par des micro-organismes et de la poussière. La croissance des semis d’Arabidopsis sur différents types de médias stériles nécessite la stérilisation des semences préalable pour éliminer les contaminants microbiens tels que les champignons et les bactéries présentes à la surface de la graine. L’utilisation d’un régime de stérilisation des semences efficace est essentielle pour un solde de germination élevé, contamination minimale et la croissance des plantes vigoureuses.
Deux principales méthodes utilisées pour la stérilisation des semences Arabidopsis reposent sur l’eau de Javel commerciale (phase liquide) et le chlore gazeux (phase vapeur). Diverses méthodes ont été employées pour les deux phase liquide stérilisation1,4,5,6,7,8,9 , graines de stérilisation 10 et vapeur-phase d’Arabidopsis8,10,11,12,13,14,15 ,16. Cependant, alors que ces procédures ont été efficaces dans l’accomplissement de la stérilisation des semences des génotypes utilisées, une analyse détaillée de l’effet de stérilisation différents traitements sur les graines de différents génotypes n’a pas signalée. Par conséquent, l’optimisation de ces procédures de stérilisation est nécessaire pour définir les conditions dans lesquelles stérilisation efficace est combinée avec des taux de germination élevé.
L’Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) occupe une position unique pour un) tester la viabilité des semences d’une variété de génotypes différents dans la collection et b) Profitez des procédures de contrôle de la qualité appliqué en interne et en réponse aux commentaires des utilisateurs sur la germination des graines. Les expériences présentées ici visait à déterminer les effets des différentes méthodes de stérilisation sur la germination des graines d’une gamme d’Arabidopsis génotypes. Procédures de stérilisation optimisée qui entraînent des taux de germination de graines élevée tout en conservant la contamination par des pathogènes minime sont présentés pour la stérilisation au gaz eau de Javel et de chlore.
Quand semer des graines d’Arabidopsis sur milieu stérile, une forme de stérilisation doit être appliquée. Traitements de stérilisation de gaz eau de Javel et de chlore entraîner semblables germination taux et moule inhibition de la croissance. Aucune méthode de stérilisation entraîne une réduction significative des taux de germination des semences à germination haut potentiel ; Toutefois, stérilisation de l’eau de Javel est recommandée pour lignes avec potentiel de germination plus faible (20 à 70 %), en raison de la petite, quoique non significatif, amélioration des taux de germination par rapport à la stérilisation au gaz (Figure 3 a).
Graines d’Arabidopsis avec eau de Javel des concentrations de 40 à 100 % jusqu’à 10 min de stérilisation offre satisfaisante taux de germination et de la suppression de moule efficace. Bien que les concentrations d’eau de Javel au moins 40 % fournissent une stérilisation adéquate pour la plupart des lots de semences, en utilisant une concentration de 40 % ou plus élevées garanties stérilisation efficace même fortement contaminées des lots de semences. Il est important de ne pas dépasser 10 min de stérilisation lors de l’utilisation d’eau de Javel concentration égale ou supérieure à 80 % afin d’éviter la mortalité élevée de graines et défauts dans le développement de la plantule.
Le traitement des graines d’Arabidopsis avec des concentrations de gaz de chlore de 6,1 % ou 16,5 % pour les résultats de 1 h dans le taux de germination élevé et élimination de moule adéquat. Concentration de gaz chlore faible (2,1 %) peut être utilisée avec succès par l’augmentation de la durée de stérilisation à 3 h.
Lorsque quelques lignes doivent être stérilisés, il est recommandée de stérilisation liquide dans une solution d’eau de Javel de 50 % pendant 10 min. Pour un plus grand nombre de lignes, la stérilisation au gaz avec une concentration de gaz de 6,1 % pendant 1 h est une meilleure option puisque plusieurs lignes peuvent être stérilisés rapidement et facilement, avec moins de manipulation.
Nos résultats fournissent des conditions normalisées pour les grand nombre de graines de différents génotypes et les semences à germination plus faible potentiel de stérilisation. La seule limitation de ces techniques de stérilisation, c’est qu’elles ne peuvent pas s’appliquer aux graines avec un taux de germination moins de 20 % en raison de la mortalité des graines. Des méthodes alternatives, telles que la sonication17, d’augmenter le taux de germination en l’absence de stérilisation peuvent être bénéfiques dans ces cas.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Gauri Datta pour son aide dans la préparation des supports expérimentaux. Nous sommes également reconnaissants à Bettina Wittler et James Mann pour l’examen critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par les subventions DBI-1049341 de la NSF et MCB-1143813.
0.65 mL Microcentrifuge tubes | GeneMate | C-3260-5 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
1.7 mL Microcentrifuge tube | GeneMate | C-3262-1 | Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
7 L plastic container | Sistema | 1016265438 | Container in which gas sterilization is performed |
Concentrated HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Chemical used in the process of creating chlorine gas |
Disposable sterile inoculating loop | Fisher Scientific | 22-363-603 | Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates |
Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | Vitamin solution used in the process of making MS media |
Household bleach | Clorox | Regular-Bleach2 | Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | Chemical used in the process of making MS media |
Micropore surgical tape | 3M | 1530-1 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | Chemical used in the process of making MS media |
Parafilm M | Bemis Company | #PM996 | Parraffin film used to seal sterilization container |
Petri dish 100 X 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
pH indicator strips | Whatman | 2613991 | Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution |
Phytoagar | Fisher Scientific | 50-255-212 | Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Chemical used in the process of making MS media |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | Chemical used in the process of liquid sterilization |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | CS70000 (Col-0) | Arabidopsis wild-type seeds |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_037606C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_041402C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_059101C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_063470C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072048C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072240C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081989C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_084124C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085049C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_089717C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107354C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110111C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111322C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113109C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114702C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114872C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115657C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_116803C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_039445C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_039782C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111584C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113339C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115837C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_019535C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_026478C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_096651C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_140643C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
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Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_143304C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_147597C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_209076C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081081C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1 |
Arabidopsis thaliana seeds | ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107487C | Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2 |