Summary

Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

このプロトコルは pentylenetetrazole と化学的キンドリングの方法を記述しててんかんのマウス モデルを提供します。このプロトコルはマウスのてんかん発作後発作誘導と病態への脆弱性を調査するも使用できます。

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) は、GABA 受容体の拮抗薬です。Subconvulsive 線量の連続注射化学たき、てんかんモデルの開発に使用されているに対し、動物に PTZ の腹腔内投与は高用量で急性、重症発作を誘発します。PTZ の低用量注射なし痙攣発作を誘発します。ただし、PTZ の繰り返し低用量注射はけいれん発作を引き起こす閾値を低下します。最後に、PTZ の連続の低用量投与は重度の強直間代発作を誘発します。このメソッドは、単純なてんかんのけいれん発作を反復を含む慢性疾患として定義される病態の調査に広く適用できます。プロトコルをたきこの化学物質は、動物の反復的な発作を引き起こします。この方法では、ptz カメラを介した発作やてんかん発作の悪化の程度への脆弱性が推定されました。これらの利点は、抗てんかん薬、てんかん関連遺伝子をスクリーニングするためのこのメソッドの使用につながっています。さらに、このメソッドは、てんかん患者の脳の組織学的変化は、化学焚かれ動物の脳にも表示されますので、てんかん発作後神経損傷を調査する使用されています。したがって、このプロトコルは、便利なてんかんモデル動物の作成に便利です。

Introduction

てんかんは、慢性神経疾患再発発作によって特徴付けられる、人々 の約 1% に影響を与えます。てんかん患者におけるてんかんと発作の生成の基になるメカニズムは、臨床試験で完全に明らかにできません。したがって、適切な動物モデルがてんかん1の調査のために必要です。

さまざまなてんかん動物モデルは、てんかんの生理学を調査し、抗てんかん薬2,3を識別するために使用されています。これらのモデルの間では、薬理学的発作誘導、てんかん4の病理学の調査のための動物モデルを生成するために使用する一般的な方法です。このメソッドは、安価で簡単です。電極を介したたきは、一般的に使用される方法が、この手順のコストが高いとメソッド反復発作5を誘導する手術や電気のスキルが必要です。

薬理学的誘導は、タイミングと発作の数をコントロールしやすいためにも便利です。自発的な発作を示す遺伝的マウスモデルもてんかんの研究に使用されます。しかし、これらの遺伝的モデルで発作が発生するタイミングと頻度を予測不可能6可能性があります。監視システムは遺伝子改変マウス6のてんかんの行動を観察する必要があります。

カイニン酸、ピロカルピン、pentylenetetrazole (PTZ) は、発作を誘発する薬7として広く使用されます。カイニン酸はグルタミン酸受容体のアゴニスト、ピロカルピンがコリン作動性受容体を活性化します。PTZ は、γ アミノ酪酸 (GABA) の受容体拮抗薬8。PTZ は、神経活動の増加につながる抑制性シナプスの機能を抑制します。この規制は、動物9の一般化された発作を引き起こします。カイニン酸とピロカルピンの単回投与は、急性発作、特にステータスてんかん重積 (SE)10,11を引き起こすことができるおよび慢性特発性と再発発作12を促進するカイニン酸やピロカルピン-仲介された SE,13。 脳波 (EEG) 録音と行動分析が自発的再発性発作が注射12,13の後の月を観察が示されています。PTZ の痙攣投与量の単回投与は、急性発作を誘導します。ただし、PTZ の単一投与後慢性特発性発作は促進するために困難です。PTZ の慢性投与は、反復発作14を誘導する必要があります。いずれかの方法で繰り返し発作の発生は急性発作の世代よりもより類似している人間のてんかんの病理を誘導することができます。PTZ、場合各注射を呼び起こす、発作と発作の重症度は、各注入と段階的により深刻になります。最後に、低用量の PTZ 注射は重度の強直間代発作を誘発します。このフェーズでは、各注入は重篤な発作を連想させます。さらに、発作の待ち時間と実行時間注射のコースに変更もできます。強直発作に待ち時間はしばしば15をたき付けの後者の段階で短くなります。さらに、発作悪化長期発作期間16と一緒に伴われます。発作の重症度を調節する分子メカニズムを解明、待機時間、および期間は、抗てんかん薬17,18,19をスクリーニングするため便利です。

発作は、PTZ の単一の全身投与によって引き起こされる一般的と回復は非常に速く、30 分4,5以内。したがって、発作の数は PTZ キンドリング モデルでより制御可能です。ただし、脳波モニタリングは PTZ を介した発作20後 12 h まで一般化されたスパイクを見ることができることを示しています。したがって、点火機構のより正確な分析のためのまたはミオクロニー強直発作21後 24 時間観察下動物のまま好ましく。

PTZ 注入の前後に抗てんかん薬のエトスクシミド、バルプロ酸、フェノバルビ タール、vigabatrin、retigabine3など管理が発作重症度3,22の悪化を軽減します。 23。同様に、ノックアウト マウス マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 924などの発作の増悪に関与して欠如遺伝子が、FGF 2225と neuritin26, を使用することを複数の PTZ 注射後減らされた発作の重症度を展示する示されています。さらに、てんかん発作はこのメソッドの後に病理組織学的変化を観察しています。側頭葉てんかん患者、苔状線維が発芽して27,28, 異常な顆粒ニューロン移行29、アストログリオーシス30, 神経細胞のような頭脳で典型的な所見があります。海馬31,32海馬硬化33年死去。同様の変化は、てんかんモデル動物で観察されます。利用可能なメソッドの中で化学的キンドリングの PTZ を介したはてんかん動物モデルを生成する、再現性のある良いと安価な方法です。ピロカルピンを介した SE モデルで発作のコントロールが難しく、多くのマウスが死ぬか SE34を開発する失敗します。対照的に、死亡率と発作の重症度は、PTZ モデルでより制御されます。また、PTZ、カイニン酸よりも安価、マウス脳外科のスキルは薬剤の投与は必須ではありません。

Protocol

すべての実験手順は、動物のケアおよび使用委員会の東京都医科学研究所によって承認されました。生後 8 – 16 週齢のマウスはお勧めします。任意の交は、実験のため許容されます。C57bl/6 マウス BALB/c とスイスのアルビノ マウス、ptz カメラより敏感に対し ptz カメラより耐性があります。C57BL/6 は、この研究で使用されました。Ptz カメラの脆弱性は、マウスの年齢によっても異なります。若…

Representative Results

PTZ の反復注射は、発作の重症度の増加を誘導します。6 c57bl/6 マウスを施した PTZ と別の 6 マウスは対照群として生理食塩水で扱われました。PTZ 投与量は 35 mg/kg と 10 注射を投与します。発作のスコアは、発作や異常行動を生理食塩水注射 (図 2) でない誘発したに対し、PTZ 注射で徐々 に増加。ボンフェローニ テスト続く分散分析は、PTZ 投与群?…

Discussion

ここでは、てんかんの薬理学的動物モデルの確立のため広くアクセス プロトコルを提案します。Ptz カメラを介した化学たきは長い歴史を持つ、てんかん41の病理組織学的および細胞の病理学の調査のための一般に受け入れられたモデルです。てんかんの化学的キンドリング モデルは Suzdak とヤンセン、1995年42以前見直されました。薬理学的発作誘導、PTZ、…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 24700349、24659093、25293239、JP18H02536、17 K 07086、文部科学省科研費助成番号 25110737、23110525、アメッド許可番号 JP18ek0109311、洗心医療研究財団と日本によって支えられた部分的てんかん研究の基礎。

Materials

Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

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Cite This Article
Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

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