שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר
Summary
שיטה פשוטה להשגת שיבוטים NK ו T תאים מחולים CAEBV פותחה עם יעילות גבוהה, כמות קטנה של דם היקפיים במינון נמוך של il-2.
Abstract
מספר שיטות כבר מתואר להקים NK/T שורות תאים מחולים עם תסמונת לימפומה או lymphoproliferative. שיטות אלה המועסקים מזין תאים, תאי NK או T מזוכך ככל 10 מ”ל של דם או של מינון גבוה של il-2. מחקר זה מציג שיטה חדשה עם אסטרטגיה חזק ופשוט להקים קווי NK ו- T cell מאת culturing ההיקפית של דם תאי תאים (PBMC) עם התוספת של recombinant il-2 בני אדם (rhIL-2), ומשתמש רק 2 מ”ל של דם מלא. התאים יכולים להתרבות במהירות בעוד שבועיים, להישמר במשך יותר מ 3 חודשים. בשיטה זו, הוקמו 7 קווים NK או תא T עם אחוזי הצלחה גבוהים. שיטה זו היא פשוטה, אמינה, החלים על הקמת שורות תאים של מקרים נוספים של לימפומה תא CAEBV או NK/T.
Introduction
וירוס אפשטיין בר (EBV) נמצא בכל מקום והוא מדביק לא רק בתאי B, אבל גם T ותאי טבעי רוצח (NK), הגורמת מספר מחלות lymphoproliferative EBV-הקשורים NK/T (LPD), לימפומה/לוקמיה, כגון EBV-הקשורים hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme כמו לימפומה, extranodal NK/T-cell לימפומה, האף סוג, NK אגרסיבי תא לוקמיה1,2,3. בין אלה הוא חמור פעיל EBV (SCAEBV) מחלה כרונית, אשר הוא האירוע בעיקר בדרום מזרח אסיה, אשר כעת נחשב LPD הנגרמת על ידי משובט הרחבה של זיהום ב- EBV T או NK תאים4,5,6, 7, אבל בלי הכשל החיסוני לכאורה נוכח מונונוקלאוזיס זיהומי (IM)-כמו הסימפטומים לרבות קדחת, hepatosplenomegaly, לימפדנופתיה בתפקוד הכבד בהתמדה או שהדו-שיח, וכן EBV גבוהים-DNA לטעון דם היקפיים8,9. חולים עם CAEBV יש10,פרוגנוזה11, ו פתוגנזה שלה, התפקיד של EBV אינה ברורה. לכן, תא קווים נגזר EBV-הקשורים NK/T lymphoproliferative מחלות, לימפומות הם מאוד מועיל כמודלים תא עבור ולהבהיר את המנגנון של EBV המושרה NK או תא T התפשטות ועל מערכת היחסים שלה עם שכיחות גבוהה של לוקמיה או לימפומה.
עד היום הוקמו מספר שורות תאים עם טכניקות שונות12,13,14,15,16. קו NK תא אנושי, NK-YS, הוקמה של לימפומה התא NK/לוקמיה, על ידי שיתוף culturing עם קו תא סטרומה העכבר מזין, וגם בנוכחות rhIL-2-ריכוז 20U לכל mL15. KAI3 היה עוד שורה התא NK הוקמה מטופלים עם אלרגיה חמורה נגד יתושים או SCAEBV עם שורת התאים lymphoblastoid עצמיים (LCL), תאים B מומר על-ידי EBV, מזין תאים, תוספת של rhIL-2-100U/mL16. SNK6, SNT8 היו נגזר גידול רקמות האף חולי לימפומה של תאי NK/T על-ידי הוספת מינון גבוה של rhIL-2 (700U/mL)12. בטכניקה דומה, התא SNK-1 היה מחולים CAEBV, תרבותי של PBMC על ידי הסרת תאי T והוספת 700U/mL של rhIL-213,17. SNT13 SNT15 הוקמו על-ידי הסרת CD4 + ותאי CD8 +18. עד כה, שורות תאים אחרים תא T ו NK מחולים EBV-NK/T LPD התפתחו עם שיטה זו19.
החסרונות של השיטות הקיימות שהוזכרו לעיל כוללים את העסקתם של תאים מזין, הדרישה של מינון גבוה של il-2, הניצול של כל 10 מ”ל דם או הטיהור של תאי NK/T, אשר הוא מאוד מאתגר במרפאה עקב נחיצות מאמת אילו סוגי תאים EBV הזה לחשוף מדביק לפני שאתם מתחילים תרבות. כפי CAEBV מתרחשת בעיקר אצל ילדים באסיה, 10 מ ל דם הוא לא קל לרכוש בכל האזורים. במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה חדש עם אחוזי הצלחה גבוהים להקים קווי NK ו/או תא T על ידי culturing PBMC מחולים CAEBV באמצעות מינון נמוך של rhIL2 ונפח של 2 מ של דם מלא ללא מזין תאים. התוצאות של שיטה זו הוכיחו את יעילות גבוהה, חיסכון בזמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, פותחה טכניקה הרומן להקמת NK/T שורות תאים מדם כל המטופלים CAEBV. לעומת השיטות הקיימות, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הפשטות שלו ודרישת שלה רק נפח קטן של דם, בזמן זה מוצגים אחוזי הצלחה גבוהים ותנאים טובים של התא הכדאיות. יתר על כן, שורות תאים NK/T יכול להתבסס על culturing PBMC מבלי לקבוע סוגי ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה את מפתח פרוייקטים של סינית האקדמיה למדעים (KFZD-SW-205), אסטרטגי ביולוגי משאבי טכנולוגיית מערכת תמיכה של סינית האקדמיה למדעים (CZBZX-1 ו- ZSSB-004), ועל ידי מענקים של קרן המדע הלאומית של סין ( 81401640) שנגחאי קרן מדעי הטבע (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
