Summary

Multimodal 접근을 이미징 Bleomycin 유도 폐 섬유 증 생쥐에서의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라

Published: April 13, 2018
doi:

Summary

우리 비-침략 적 multimodal 접근 bleomycin의 이중 intratracheal 주입에 의해 유도 된 마우스 폐 섬유 증 모델의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라 이미지를 설명 합니다.

Abstract

특 발성 폐 섬유 증 (IPF) 치명적인 폐 질환 폐 기능 및 호흡 실패에서 후속 죽음에 상당한 저하를 일으키는 원인이 되는 폐 아키텍처의 진보와 돌이킬 수 없는 파괴에 의해 특징입니다.

실험 동물 모델에서 IPF의 병 인 bleomycin 관리에 의해 유발 되어 있다. 이 연구에서 우리는 이중 intratracheal bleomycin 주입에 의해 유도 된 IPF 같은 마우스 모델 조사. 폐 섬유 증 공부에 사용 하는 표준 조직학 평가 침략 터미널 절차. 이 작품의 목표 모니터링 하는 데 비 침 투 적인 이미징 기법 형광 분자 단층 (FMT)와 마이크로 CT 등을 통해 폐 섬유 증 조직학 결과 함께 유효성을 검사 하는 이러한 두 기술을 실시간으로 비-침략 적 IPF 질병 엄격과 진행의 모니터링을 위한 혁신적인 functional 접근을 대표할 수 있었다. 다른 방식의 융합이 나타냅니다 IPF 질병, 병 적인 상태에서 발생 하는 분자 이벤트 FMT 관찰 될 수 있다 및 후속 해 부 변화 마이크로-코네티컷으로 모니터할 수 있습니다 이해에 대 한 추가 단계를

Introduction

특 발성 폐 섬유 증 (IPF)은 불행히도 종종 치명적인 진단1의 4 년 이내 폐 기능의 진보적인 감소와 만성 폐 질환 이다. IPF의 주요 특징은 세포 외 매트릭스 증 착 및 섬유 아 세포 확산, 하지만 병 인은 아직 완전히 이해 되지 않습니다. 가장 지원된 가설 폐 상해의 여러 사이클 중간 엽 세포 주기 확산의 변경, 섬유 아 세포와 myofibroblasts, 과장 된 축적 하는 폐 포 상피 세포의 파괴를 일으키는 원인이 되 고 증가 매트릭스 생산입니다. 중재자와 같은 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 섬유 증 개발 인간의 IPF 또는 bleomycin 유발 동물 모델에서에서 dysregulated 발견 되었습니다 이러한 프로세스에 참여. 통제 MMP 생산 리드는 불균형된 콜라겐 증 착 폐 interstitium 및 치조 공간 내에서 비정상적인 상처 수리1,2를 흉내 낸.

약물 발견 및 개발에 대 한 주요 장애물 중 하나 인간의 pathogenesis 및 질병 표현 형을 모방 액세스할 수 마우스 모델의 가용성입니다. 다른 에이전트 동물 모델에서 폐 섬유 증을 유발 하는 데 사용 되었습니다: 방사선 손상, 석면, 실리 카, fibrinogenic cytokines 및 bleomycin3,4; 관리의 관리 그러나 bleomycin은 가장 사용 되는 쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터, 토끼5 또는 큰 동물 (비 인간 대주교, 말, 개 및 반추 동물)6,7. Bleomycin은 Streptomyces verticillus8 박테리아에 의해 항생제 이며 항 암 에이전트9로 사용 됩니다. 폐 섬유 증 및 이런 이유로 약물의 일반적인 부작용, 폐 섬유 증을 유도 하기 위해 실험 동물 모델에서 사용 됩니다.

Bleomycin 유도 폐 섬유 증 모델에서 거리 병 변 발생 bleomycin 관리 후 14-21 일. 제시 작품 우리 이중 bleomycin intratracheal 주입에 의해 쥐에서 폐 섬유 증을 유발 하는 새로운 프로토콜을 사용 합니다. Bleomycin 마우스 모델은 새로운 약물 설립된 거리 병 변, 평가 될 필요가 있기 때문에 매우 시간이 소모 하 고 항 염증 효과에서 그들의 반대로 거리 효과 구별 하는 테스트.

콜라겐 콘텐츠, morphometrical 및 조직학 분석의 생 화 확 적인 결정 했다 같은 동물에 있는 질병의 병 인에 따라 가능성을 제한 하는 게시물 부검 분석을 기반으로 합니다. 비록 이러한 매개 변수는 섬유 증 평가 대 한 황금 표준 간주 됐다, 그들은 거리 병 변의 어떤 시간적 또는 공간적 분포를 제공 하지 않았고 질병 진행의 과정을 조사 하는 방법을 배제. 10

최근, 비-침략 적 이미징 기술을 적용 된 모니터 기도 개장, 염증, 및 murine 모델 진행 성 섬유 증: 자기 공명 영상 (MRI), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT), 형광 분자 단층 (FMT) 및 발광 (BLI)11,12,13,14,15,,1617,18,19 ,,2021. 우리는 경도 다른 시간 점에 후 한 bleomycin 도전22FMT와 마이크로 CT, 폐 섬유 증 진행을 모니터링 하는 비-침략 적 이미징 접근 방식을 제안 합니다.

많은 경로 설립 및 섬유 증의 개발에 참여 하 고 별로 알려져 있다. 이러한 프로세스의 더 깊은 이해만 병원으로 전송할 수 있습니다 더 많은 약물 목표 번역할 수 있습니다. 경도 마이크로-CT에 의해 폐 parenchymal 변경의 탐지를 결합 하는 형광 분자 단층에 의해 MMP 활성화를 모니터링 하는 기능 치료에 임상 응답 액세스 하려면 나중에 사용할 수 있습니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 동물 실험 프로토콜 번호 아래 Chiesi Farmaceutici와 에라스무스의 동물 실험에 대 한 교내 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다: 유럽 지침 2010/63 UE 준수 EMC 3349 (138-14-07) 이탈리아 D.Lgs 26/2014 고 개정된 “가이드에는 관리 및 사용의 실험실 동물”23. 참고: 사용, 이전 여성의 타고 난된 C57Bl/6 (7-8 주 이전) 마우스 했다 acclimatized 로컬 물고기 조건?…

Representative Results

폐 섬유 증 장애의 자연 해상도 3 주 후이 모델의 한계를 강조 하는 단일 bleomycin 관리 및 적당 한 구조 변화를 관찰 했다. 예방 치료만 임상 연습17나타내지 않는 좁은 치료 창 때문 수행 될 수 있습니다. 여기, 우리는 이중 bleomycin intratracheal 주입의 우리의 프로토콜은 쥐18에 오래 견 딘 폐 섬?…

Discussion

많은 연구 그룹 새로운 약물을 개발에 초점을 맞추고 IPF의 치료에 불구 하 고 현재 2만 사용할 수 있습니다 환자에 대 한. 의료 긴급 하기 때문에 더 효과적인 치료7 을 찾이 필요가 폐 transplantationis 4-5 년26의 생존을 머리말을 붙이는 수. 변환 의학 및 신약의 개발에 대 한 필수적인 전제 조건 어떤 중재 연구는 병원에서 성공의 예측에서 IPF의 기능을 모방 하는 동…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 박사 다니엘 Pompilio와 로버 타 Ciccimarra 기술 도움에 감사 하 고 싶습니다.

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

References

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
  23. . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).

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Cite This Article
Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

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