このプロトコルは、タグ付きの観測リアルタイム緑色蛍光タンパク質 (GFP) のブドウ糖の運送者 4 (GLUT4) タンパク質インスリン刺激とインスリン-GLUT4 の CCR5 の生物学的役割の評価時に人身売買の手法を記述します。デコンボリューション顕微鏡を用いたシグナル伝達。
2 型糖尿病 (2 型糖尿病) インスリン シグナル伝達障害と末梢組織に慢性的な炎症によって特徴付けられる世界の健康危機であります。中枢神経系 (CNS) の視床下部は、エネルギーおよびインシュリン信号応答の規則のためのコントロール センターです。末梢組織の不均衡 (CCL5、tnf α、IL-6 など) 特定のケモカインの慢性的な炎症は、糖尿病や肥満に貢献します。しかし、ケモカインと視床下部のインスリン シグナル伝達制御まだ接続機能の機構は不明します。
一次ニューロン文化モデル体外は、インスリン シグナル調節視床下部ニューロンを調査する使用ことができます便利でシンプルなモデルです。本研究では、インスリン刺激による GLUT4 膜移行を追跡するためのプライマリの視床下部ニューロン、外因 GLUT4 タンパク質 GFP (GFP GLUT4) の共役を導入しました。GFP GLUT4 タンパク質輸送のコマ撮り画像デコンボリューション顕微鏡実験を行いながらニューロンを大幅に損なうことがなく高速、高解像度の画像を生成するユーザーが記録しました。インスリン調整される GLUT4 転座 CCR5 の貢献は分離され、CCR5 欠損マウスから培養 CCR5 欠損視床下部ニューロンで観察されました。我々 の結果は、インスリン刺激後、CCR5 欠損視床下部ニューロンの GLUT4 膜転流効率が減ったことを示した。
2 型糖尿病 (2 型糖尿病) は、世界的な健康危機です。2 型糖尿病は、インスリン シグナル伝達障害と末梢組織に慢性的な炎症によって特徴付けられます。視床下部は、体のエネルギー代謝、食欲および概日リズムを調節するコントロール センターです。最も重要なは、視床下部も全身代謝1,2,3,4,5を調節するインスリン シグナル応答を仲介します。視床下部のインスリン シグナル経路は、インスリン抵抗性6,7を誘発する可能性を中断すること。視床下部は、細胞のエネルギー状態およびインスリンなどアディポカイン (例えばレプチン) 全身糖代謝、インスリン応答性と食品の摂取量を調節する、末梢組織からのホルモンの分泌を調整します。インスリン受容体のインスリン結合活性化インスリン受容体基質 (IRS) 蛋白質は、PI3K など、下流のシグナリング分子にインスリンをアクティブ化 (ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ)、GLUT4 を誘発する AKT (タンパク質キナーゼ B (PKB/AKT))膜の転流。ニューロンはインシュリン; への応答でのグルコース取り込みのための主要なターゲットではないです。ただし、GLUT4 の発現の重要なレベルは、視床下部の弓状核 (ARC) 地域で識別されています。したがって、視床下部ニューロンの GLUT4 の規制は脳末梢の軸におけるインスリン シグナルに重要な役割を果たす可能性があります。
多くの研究は、慢性炎症と炎症性ケモカイン視床下部にも糖尿病や肥満の開発に重要な役割を果たしてし、視床下部の炎症の抑制は食餌誘導性インスリン抵抗性を逆転できることを示唆しています。8,9,10します。 さらに、ケモカイン CCL5 (C C モチーフ配位子 5、別名 RANTES Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) と 2 型糖尿病11,12の開発と相関してその CCR5 受容体レベル。インスリン機能と糖代謝における CCL5 と CCR5 の役割は不明します。1 つの研究報告 CCR5 の欠乏が肥満誘起性炎症、マクロファージ募集およびインスリン抵抗11; からマウスを保護すること対照的に、別の研究は、CCR5 不足が脂肪細胞と筋肉のインスリン シグナル12と同様、全身のグルコース耐性を損なうことを報告しました。CCL5 は T 細胞でのグルコース取り込みを増加して、視床下部13,14, しかし、アクション機構への作用を食品の摂取量を減らすために発見され、受容体の関与はまだ識別すること。
インシュリンは視床下部ニューロンの機能に及ぼす周辺組織の炎症細胞メカニズムを研究することは困難です。これは細胞の不均質性とニューロン回路のフィードバック規制のためです。この理由は、細胞の in vitro培養モデルは視床下部インシュリン信号調節に、ケモカインの影響を調査するためきれいなモデルを提供します。多くの確立された研究用不死視床下部神経細胞にありますが、これらの細胞株の別のマーカーの表現し、したがって、視床下部ニューロン15の異なる種類を表します。プライマリ視床下部文化を維持することは困難にすることができます、にもかかわらず彼らはインスリン刺激時に視床下部ニューロンの最も現実的な応答を提供することができに来る未知の影響細胞を維持するときに再生の可能性を回避することも人工増殖因子と培地の長期的です。
ここ、C57BL/6 (WT) 野生型マウスと CCR5 ノックアウト (CCR5-/-) マウスからプライマリ視床下部ニューロンを活用し、transfect GFP GLUT4 の構造と細胞の両方の種類。CCR5 のインスリンによる GLUT4 膜輸送への貢献のため、GFP GLUT4 トランスフェクション細胞はインスリンや組換え CCL5 と扱われました。我々 は、GFP GLUT4 のデコンボリューション顕微鏡による主な視床下部ニューロンの細胞膜上の動きを特徴付けます。
CCL5 またはインスリン刺激時の生きているセルを監視する機能は、GLUT4 の動きに CCL5 またはインスリンの急激な効果を研究するため極めて重要です。実際には、それは WT と CCR5 の-/-視床下部ニューロン刺激によるインスリンの重要な違いを視覚化することができます。インスリン刺激17後 WT と CCR5 の-/-視床下部ニューロン異なる時点での内因性の GLUT4 タンパク質の表面の分類を行った。セル表面蛋白質の分類低バック グラウンドと特異性の高い抗体が必要です。さらに、表面の蛍光定量は困難で時間がかかるできます。したがって、コマ撮り録画 CCL5 の効果ことを確信することができます。 またはインスリンは実験条件ではなく、統計的変動に基づく真の生理の変化。表面の内因性 GLUT4 の分類、一緒には、強力な証拠と GLUT4 転流とインスリン シグナルに CCL5 と CCR5 の参加方法を実証する実験を提供します。
現代細胞生物学と分子生物学の研究は、多くの実験は、蛍光顕微鏡の利用を必要とします。この技術に蛋白質および/または移動方向と速度、促進効果、形態学的変化および蛋白質の売買だけでなく、細胞細胞器官間の空間関係を視覚化できます。しかし、この技術はその限界: 背景の蛍光性によって標的タンパク質 (または領域) から発する信号を圧倒できます fluorophores が興奮しているとき。その結果、蛍光画像が背景信号に深く埋葬された予想される信号ぼやけて表示されます。この現象は特に膜結合タンパク質の観察です。
全内部反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) は、この困難を克服するために開発されました。バック グラウンド蛍光物質に影響を与えずに選択した表面結合 fluorophores の励起を視覚化する科学者をことができます。機能や細胞膜などの非常に薄いサーフェス領域上のイベントを選択的に特徴付けるため科学者をことができます。デコンボリューション顕微鏡は、近年の技術の進歩の助けを借りて可能です処理計算集約的なイメージです。それは、デジタルの蛍光画像の解像度を改善するために頻繁に利用されています。以前、説明したように、fluorophores が付いている照明 (レーザー、LED など) の任意の型に興奮しているときは、すべて fluorophores が付いて出力光信号に関係なくかどうか、焦点が合っている場合イメージが常にぼやけて表示されますのでします。このボケと呼ばれる「点広がり関数」(PSF)、小さな蛍光ソース (明るいスポット) から光を来るがさらに広がるし、ピンぼけ (ぼかし) になる現象が原因です。原則として、このイベントは砂時計のような形をした蛍光信号を生成、蛍光イメージは、このような多数の信号ので構成できます。デコンボリューション処理は、元の明るいスポット形式にすべての蛍光信号を再割り当てし、イメージのコントラストを改善するためにアウト フォーカスの光の大部分を排除できます。
近年、デコンボリューション アルゴリズムは、共焦点顕微鏡に匹敵する解像度を持つ画像を生成しています。さらに、観察、比較では広視野顕微鏡により、すべての光を検出する信号し、デコンボリューション処理を通じて彼らの源に戻ってそれらを再割り当て制限励起領域によって検出されるからアウト フォーカスのぼかしを防ぎます。したがって、実際は、デコンボリューション顕微鏡はより効率的な画像取得方法だけでなく、全反射型顕微鏡と比較してよりコスト効果の高い方法になっています。
The authors have nothing to disclose.
S Y C に省の科学と技術, 台湾 – たばこ製品の MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) と保健医療福祉有料 – MOHW106-TDU-B-212-144001 によって提供される助成金を感謝しております
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |