Summary

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

Published: August 31, 2017
doi:

Summary

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Abstract

El objetivo de este protocolo es para aislar el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) DNA de las células infectadas para la identificación de asociado viral y celulares proteínas por espectrometría de masas. Aunque proteínas que interaccionan con genomas virales desempeñan un papel importante en determinar el resultado de la infección, un análisis exhaustivo de las proteínas del genoma viral asociado no era previamente posible. Aquí nos muestran un método que permite la purificación directa de los genomas de HSV-1 de las células infectadas. Replicación de ADN viral selectivamente se etiqueta con nucleótidos modificados que contienen un grupo funcional de alquino. Etiquetado ADN es entonces irreversible y específicamente etiquetada vía el accesorio covalente de la azida de biotina través de cobre (I)-catalizado reacción de cicloadición o clic de azida-alquino. DNA etiquetados biotina es purificado en bolas recubiertas de estreptavidina y las proteínas asociadas son eluidas identificadas por espectrometría de masas. Este método permite la focalización selectiva y el aislamiento de las horquillas de replicación de HSV-1 o genomas enteros de entornos biológicos complejos. Además, la adaptación de este enfoque permitirá la investigación de diversos aspectos de la infección herpética, así como el examen de los genomas de otros virus ADN.

Introduction

Virus tienen una capacidad limitada para realizar las funciones esenciales y por lo tanto depende de factores del anfitrión para facilitar los aspectos más importantes de infección que incluye transporte, replicación, reparación, recombinación y expresión génica viral. Las actividades de estos factores de host están a menudo aumentadas por proteínas virally codificadas. Además, el virus deben evitar detección e interferencia por respuestas celulares a la infección viral. Por lo tanto, las interacciones host de virus determinan el resultado de la infección. De primordial importancia es entender cómo virus alteran el ambiente celular para adaptar la maquinaria celular para facilitar procesos virales. De particular interés es identificar qué factores y procesos que actúan sobre genomas virales durante todo el ciclo infeccioso.

Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es que un doble trenzado DNA virus que infecta una parte sustancial de la población humana. En la primera hora de la infección, el genoma viral entra en el núcleo, donde una cascada de pedidos de la expresión génica viral sobreviene en coordinación con el viral de replicación de ADN (vDNA)1. En el núcleo, genomas están sujetas a regulación epigenética, se someten a reparación y recombinación y se empaquetan en la cápsida, que los primeros viriones de progenie se producen en menos de seis horas. La evaluación integral de las proteínas del genoma viral asociado a través del curso de la infección será sentar las bases para investigar los detalles moleculares de los procesos que actúan en genomas virales y se proporcionan la penetración en qué factores virales y celulares participan en distintas etapas de la infección.

Los métodos anteriores para la investigación de factores de huésped implicados en la infección viral incluyen la purificación de la afinidad de las proteínas virales para el análisis de las proteínas celulares asociadas2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estos ensayos han sido instrumentales para la identificación de los factores celulares implicados en las respuestas antivirales host, así como modificación de la cromatina viral, la expresión génica, y reparación del ADN. Sin embargo, es difícil determinar si las interacciones dependen de la asociación con vDNA y proteómica sólo proporciona la penetración en las interacciones que se producen en función de un factor viral específico. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se ha utilizado para identificar donde se unen las proteínas virales y celulares específicas a genomas virales10,11,12,13,14 , 15 y la hibridación in situ fluorescente (FISH) combinado con inmunocitoquímica ha permitido la visualización de los factores celulares que colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. estos ensayos permiten análisis espacial y temporal. Sin embargo, limitaciones incluyen la necesidad de anticuerpos altamente específicos, sensibilidad limitada y la necesidad de la visión anterior de las interacciones host de virus. Por lo tanto hemos desarrollado un método basado en iPOND (aislamiento de proteínas de ADN naciente)21 y aniPOND (acelerada nativa iPOND)22 selectivamente etiqueta y purificar vDNA de infectado las células para la identificación objetiva de genoma viral proteínas asociadas por espectrometría de masas. iPOND ha sido fundamental para la investigación de la dinámica de la bifurcación de replicación celular.

Para la purificación selectiva de los genomas virales de las células infectadas, replicar vDNA está etiquetado con nucleósidos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) o 5-ethynyl-2´-desoxicitidina (EdC) (figura 1), seguido de covalente verbal a azida de biotina a través, haga clic en química para facilitar la purificación del solo paso de genomas virales y las proteínas asociadas en bolas recubiertas de estreptavidina (figura 2B). Lo importante, las infecciones se llevan a cabo en las células fijas, que no participan en la replicación del ADN celular para permitir el etiquetado específico de vDNA. Además, la infección HSV-1 causa la detención del ciclo celular e inhibe celular ADN replicación23,24. Virus puede ser prelabeled antes de la infección para el análisis de proteínas relacionadas con genomas virales entrantes (figura 1A) o marcado durante la replicación del ADN para el análisis de proteínas relacionadas con vDNA recién sintetizada (figura 1B) 25. Además, los análisis de chase de pulso pueden utilizarse para investigar la naturaleza de las proteínas asociadas con la replicación viral las horquillas (figura 1)26. Además, vDNA ethynyl-modificado puede ser covalentemente conjugado con un fluoróforo de investigación espacial de la dinámica de la proteína (figura 2A y figura 3). La proyección de imagen permite la visualización directa de vDNA es un método gratuito para la validación de las interacciones vDNA-proteína y puede ser adaptada para rastrear genomas virales a lo largo de la infección. Esperamos que estos enfoques podrían modificarse aún más para el estudio de cualquier aspecto de la infección herpética, incluyendo latencia y reactivación y para el estudio de otros virus ADN. Por otra parte, etiquetado con uridina 5-ethynyl (UE) podría permitir el análisis de genomas virales de RNA.

Protocol

1. cultivo celular, infección Viral y etiquetado de EdC ( figura 1) el siguiente protocolo implica trabajar con virus. Por favor, consulte a su institución ' protocolos de bio-seguridad de s sobre manejo seguro de virus y otros agentes biológicos. Este protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh. Trypsinize un frasco de cultivo de tejidos 2 150 cm confluentes de células MRC-5 y las c…

Representative Results

El uso de la química del tecleo para la purificación de la DNA de las células primero fue logrado por el método de iPOND21. El propósito de iPOND es purificar las horquillas de replicación celular para la identificación de las proteínas asociadas. Hemos adaptado esta técnica para estudiar específicamente las interacciones proteína vDNA durante la infección. Manipulación del acercamiento a la etiqueta de genomas virales con EdC (fig…

Discussion

Este protocolo incluye varios pasos que, si no siguen cuidadosamente, pueden resultar en rendimiento de proteína redujo significativamente o contaminación con el ADN celular. Es esencial que las células fijas se utilizan para todos los experimentos para asegurar que el ADN celular no es etiquetado y purificada. Esto puede confirmarse por la ausencia de polimerasas de la DNA celulares en la muestra de proteína debido a HSV-1 no utilizar celular polimerasa de la DNA para la síntesis del genoma. EdC etiquetado y núcle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos Hannah Fox para ayuda en la preparación de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant R01AI030612.

Materials

MRC-5 cells ATCC CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-082 substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish Thermo Fisher Scientific 166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column) GE Healthcare 17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) Sigma-Aldrich T511307 Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
2´-deoxycytidine (deoxyC) Sigma-Aldrich D3897 Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
Nuclear Extraction Buffer (NEB) prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper Bellco glass 7731-22000 Autoclave before use
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
PBS, pH 7.2 (10x) 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) Fisher Scientific C489 Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide Invitrogen B10184 Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year 
Click Reaction Mix prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)  
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001 Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1 prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2 prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3 prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe Sonics VCX 130
Cell strainer Falcon 352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65601
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 260750F
2X Laemmli sample buffer Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube Fisher Scientific NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
12-well tissue culture dish Corning 3513
Coverslips Fisher Scientific 12-545-100 Autoclave before use
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-5
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605 prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) Sigma-Aldrich T8787 prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Molecular Probes C10337 prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342 Life Technologies H1399 prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody Abcam ab20194 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) Abcam ab19311 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody Life Technologies a11005 Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
2x SDS-bicarb solution 2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks 65 °C and 95 °C

References

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

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Cite This Article
Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56374, doi:10.3791/56374 (2017).

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