Summary

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Published: August 09, 2017
doi:

Summary

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Abstract

Dentro del sistema inmune innato, los linfocitos efectores conocidos como células de naturales del asesinas (NK) juegan un papel esencial en la defensa del huésped contra las células aberrantes, especialmente eliminando tumoral y viralmente infectadas las células. Aproximadamente 30 defectos monogénicas conocidos, junto con una serie de otras condiciones patológicas, deficiencia funcional o clásico NK célula, que se manifiesta en reducción o ausencia de actividad citotóxica. Históricamente, se ha investigado la citotoxicidad con métodos radiactivos, que son engorrosos, costosos y potencialmente peligrosos. Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo aerodinámico, clínicamente aplicable para cuantificar la actividad citotóxica de células NK. En este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o preparaciones de células NK purificadas son co se incubó a relaciones diferentes con una línea de células de tumor objetivo sabida que es sensible a la citotoxicidad mediada por células NK (NKCC). Las células diana son las marcadas con un colorante fluorescente para permitir la discriminación de las células efectoras (células NK). Después del período de incubación, las células diana mataron son identificadas por una mancha de ácido nucleico, que impregna específicamente células muertas. Este método es susceptible de diagnóstico y aplicaciones de investigación y, gracias a las capacidades de múltiples parámetros de la citometría de flujo, tiene la ventaja añadida de que potencialmente permite un análisis más profundo del fenotipo de la célula NK y la función.

Introduction

Células de naturales del asesinas (NK) son un subconjunto sofisticado de linfocitos innatos humanos críticamente implicados en la eliminación de las células viralmente infectadas, las células transformadas y otras amenazas patógenas 1,2. Casa de gránulos líticos de la célula NK proteínas citotóxicas, como perforin y granzymes. Tras la activación, las células NK forman una interacción compleja con sus objetivos conocidos como sinapsis inmunológica, por el que estas moléculas citolíticas se liberan localmente, dando por resultado la lisis de la célula objetivo directo y apoptosis, junto con liberación de citoquinas y quimioquinas y en última instancia en la inducción de un inflamatorio estado 1,3,4.

Activación de la célula NK involucra una compleja cadena de activación y las interacciones inhibitorias entre NK célula receptores y ligandos expresadas en la superficie de las células de la blanco, formando un sistema fuertemente regulado. Uno de los mecanismos más estudiados de la activación de células NK es la “falta”. De hecho, falta de detección de clase en que mayor complejo de histocompatibilidad (MHC), o moléculas de leucocito humano antígeno (HLA), infectados o transformado citotoxicidad celular de células desencadenantes NK. Tumorales y células infectadas por virus generalmente regular a la baja estos antígenos para escapar de la inmunidad mediada por células T, convirtiéndose en principal NK célula objetivos 1,3,4.

Evaluación de la función de la célula NK se categoriza principalmente en degranulación o citotoxicidad ensayos. Sin embargo, ensayos de degranulación, como detección de citometría de flujo del degranulation asociados marcador CD107a, sólo son indicativos de la activación de células NK y no de su función final, la muerte directa de las células objetivo 5,6,7,8. Por lo tanto, esta limitación ha dibujado los investigadores ensayos de citotoxicidad como alternativa más directa y más revelador.

El largo plazo “gold standard” para evaluar la actividad citotóxica mediada por células de las células T y NK es el ensayo de liberación de cromo (CRA). CRA implica radiactivo etiquetado de células diana con 51Cr y co los incuban con las células efectoras. Este ensayo se empapa en el principio que lisis celular resulta en la liberación de proteína determinada 51Cr en el sobrenadante, que puede ser medido contando gamma. Este ensayo, al mismo tiempo eficaz, es problemático para una variedad de razones: altos costos de material, manejo y disposición de radiactivo 51Cr, lanzamiento espontáneo de 51Cr y difícil estandarización – lo que en conjunto práctico 9,10.

Un número de ensayos no radiactivo, con etiquetado fluorescente, liberación de enzima e incluso bioluminiscencia, desde entonces se han desarrollado como alternativas a la CRA 11,12,13,14. Aquí describimos un método basado en la citometría de flujo para medición de NK célula actividad citotóxica en las células K562 objetivo simple, sensible y reproducible. Células K562 son una células erythroleukemic humana la línea con menor expresión de HLA clase I y una mayor expresión de ligandos para receptores NK activatory, que los hace particularmente susceptibles a NK Citotoxicidad mediada por células 15. En este ensayo, las células K562 están marcadas previamente con carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster (CFSE) y cultivan conjuntamente en diferentes proporciones con cualquiera células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o purificaron de células NK 1. CFSE es un colorante fluorescente estable, proteínas de Unión que permite la discriminación de las células de la blanco del efectoras NK células 16,17. Después de la incubación Co, una mancha de ácido nucleico, específicamente impregnando la membrana de las células muertas, se utiliza para identificar las células de la blanco matado (véase tabla de materiales). Las muestras entonces se adquieren en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de muertos (es decir, mancha +) CFSE + células diana.

Este ensayo puede utilizarse como una investigación rutinaria de diagnóstico para defectos monogénicas, que afectan el compartimiento de células NK, que son aproximadamente 30 defectos conocidos que causan deficiencia de células NK ya sea funcional o clásica, y para el lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secundario. También es útil para investigar la actividad de células NK en pacientes con infecciones virales herpes recurrente, grave, para evaluar la reconstitución inmune tras el trasplante de células hematopoyéticas o post inmunomoduladores terapia 18,19,20y de una serie de aplicaciones de la investigación básica.

Protocol

Samples were collected according to the ethical guidelines established by the UCLA Human Research Protection Program and IRB approved. 1. Preparation of reagents NOTE: Unless otherwise stated, all reagents should be allowed to equilibrate at room temperature prior to use. All reagents must remain sterile. Prepare a 2x working solution of Tween-20 (i.e., 0.2%) by adding 10 µL of Tween-20 solution to 5 mL of phosphate-buffered saline (PBS) withou…

Representative Results

Antes de establecer el ensayo, se recomienda evaluar contenido de células NK en la población de efector de elección. La figura 1 muestra una típica coloración CD56 antes (azul claro) y después de enriquecimiento de células NK (rojo). Las células NK constituyen hasta un 15% de PBMCs y deben ser por lo menos 80% de pureza después de enriquecimiento. El análisis cytometric del flujo en este e…

Discussion

El método descrito aquí proporciona una alternativa sencilla y rentable para el ensayo de lanzamiento tradicionales 51Cr para evaluar la actividad citotóxica de células NK. Este método es sensible, reproducible y menos desperdiciador de tiempo que los anteriores métodos estándar, como CRA y puede ser utilizado para ambas clínicas y aplicaciones de investigación.

Mientras que el ensayo trabaja con total PBMCs y enriquecida de las células NK, la opción de usar PBMCs sin la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Jill Narciso, centro de inmunogenética de UCLA, por su asistencia con la preparación del manuscrito.

Materials

Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) Corning (Cellgro) 21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
Tween-20 Sigma BP337-100
RPMI 1640 Media Corning (Cellgro) 10-040-CV
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-163 Stock solution at 10,000 U/mL
IL-2 R&D Systems 202-IL-050 Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)
K562 Cells ATCC CCL-243 Cancer cell line 
T-75 cell culture flasks Corning 431464
CFSE cell proliferation kit Life Technologies (CellTrace) C34554 Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.
Sytox Red Life Technologies S34859 Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.
Sodium/lithium heparin blood collection tubes BD 02-687-95
U-bottom 96-well plate Corning CLS3897
Serological pipettes BD Falcon
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) BD Falcon 14959-5
50 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352070
15 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352097
Reagent reservoir USA Scientific 2321-2230
Human NK cell enrichment cocktail StemCell Technologies (RosetteSep) 15065

References

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).

View Video