Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도
Summary
인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.
Abstract
Xeno-free 및 완전 정의 된 조건은 균질 한 사람 유도 pluripotent stem (hiPS) 세포의 강력하고 재현성있는 생성을위한 핵심 매개 변수입니다. 피더 세포 또는 정의되지 않은 매트릭스상의 hiPS 세포의 유지는 배치 차이, 병원성 오염 및 면역 원성의 위험에 취약하다. 제노 프리 및 정의 된 배지 배합물과 조합하여 정의 된 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스를 사용하면 변이가 감소하고 hiPS 세포의 일관된 생성이 가능해진다. 센다이 바이러스 (SeV) 벡터는 비 통합 RNA 기반 시스템이므로 벡터 통합 벡터가 가질 수있는 게놈 무결성에 대한 파괴적인 효과와 관련된 우려를 회피 할 수 있습니다. 또한, 이들 벡터는 진피 섬유 아세포의 재 프로그래밍에서 비교적 높은 효율을 입증 하였다. 또한, 세포의 효소 단일 세포 passaging은 줄기 세포의 실질적인 사전 경험없이 hiPS 세포의 균질 유지를 용이하게합니다문화. 여기서는 재현성과 사용 용이성에 중점을두고 광범위하게 시험하고 개발 한 프로토콜을 기술하여 섬유 아세포에서 정의되고 이종없는 인간 hiPS 세포를 생성하는 강력하고 실질적인 방법을 제공합니다.
Introduction
다카하시 (Takahashi) 등에 의한 hiPS 세포주의 일차 유도 이후, 1 , 2 , hiPS 세포는 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의학 3 에서 세포 치료법을 생성하기위한 원료 물질로서 유용한 도구를 제공합니다. hiPS 세포 배양은 오랫동안 섬유 모세포 피더 세포 4 , 5 또는 Matrigel 6 및 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지 배합물과 함께 공 배양에 의존 해왔다. 일괄 배치 (batch-to-batch) 편차는 이러한 배양 조건의 정의되지 않은 특성의 공통적 인 결과이며 예측할 수없는 변형을 가져 오며 이는 이러한 프로토콜의 신뢰성을 저해하는 주요 원인입니다. Essential 8 (E8) 8 및 정의 된 세포 배양 기질, 예를 들어 LN-521 9 와 같은 한정 배지의 개발은재현성있는 프로토콜을 확립하고 homogenous hiPS cell 7 , 8 , 9 , 10 의 강력한 생성 및 유지를 돕습니다.
통합 자유 재 프로그래밍 기술의 개발은 도약을 가져 왔습니다. 원래 재 프로그램은 레트로 바이러스 벡터에 의존하여 무작위로 게놈에 통합되어 게놈 무결성에 파괴적인 영향을 미쳤습니다. 리 프로그래밍 방법의 발전에는 RNA 기반 벡터의 개발이 포함됩니다. RNA 벡터는 게놈 재조합을 통한 의도하지 않은 통합이 가능하지 않기 때문에 DNA 기반 재 프로그램 방법보다 이점이 있습니다 12 . SeV 벡터는 DNA- 상 11 없이 단일 가닥 RNA를 통해 외인성 인자를 과도하게 높게 발현한다. SeV에 의해 전달 된 재 프로그래밍 벡터세포 배양 전반에 걸쳐 희석되고 궁극적으로 배양 물로부터 흘려 발판 인쇄 방법으로 재 프로그램 할 수 있습니다. 그 후, pluripotency의 유지는 pluripotency 유전자 2 의 내인성 발현에 의존합니다.
선구적인 hiPS 세포 기반 치료법이 임상 시험으로 옮기기 시작함에 따라 표준화 된 배치, 재현성 및 안전성에 대한 요구가 13을 해결하는 데 필수적인 문제입니다. 그러므로 동물 기원의 제품은 피해야한다. 예를 들어, 이종 생산물의 사용은 비인간 병원균 오염의 위험과 관련되어있다. 또한, 동물 유래 배양 성분의 존재 하에서 배양 된 세포는 비인간 실리아 산을 세포막 내로 도입시켜 유도 된 세포를 면역 원성으로 만드는 위험이있다. 따라서 이종 제품을 제거해야 할 필요성은 앞으로의 임상 적 진료에 필수적입니다. 이 프로토콜은 xe를 적용합니다.세포를 임상 순응에 더 가깝게 이동시키는 hiPS 세포의 유지에 자유롭고 정의 된 배양.
이 프로토콜은 섬유 아세포에서 표준화 된 hiPS 세포를 생성하는 일관되고 재현성 있고 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 기존의 hiPS 세포를 유지 관리 할 수있는 친숙한 배양 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜은 Karolinska Institutet의 스웨덴 국가 인체 iPS 코어 시설에서 300 줄 이상의 hiPS 세포주를 추출하는데 사용되어 왔으며이 중 일부 줄은 이미 15 , 16 에 기술되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 예상 결과는 여러 clonally derived hiPS 세포 라인의 성공적인 생성입니다. 중요하게, 여기에 기술 된 확립 된 hiPS 세포의 유지 및 확대를위한 방법은 신뢰성이 있고 줄기 세포 배양의 경험이 거의없이 수행 될 수있다. LN-521 매트릭스와 함께 ROCKi와 함께 효소 단클론 항체는 식민지 기반의 구강이 10 , 19 , 20을 자극 할 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 SSF (B13-0074)와 VINNOVA (2016-04134) 자금 지원 기관에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
